Geri Dön

Protein kalite kontrolünde görev alan FtsH-HflKC protein kompleksinin yapısal biyolojisi

Structural biology of FtsH-HflKC protein complex involved in protein quality control

PDF İndir

  1. Tez No: 860523
  2. Yazar: GÜNCE GÖÇ
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ, DR. BURAK VELİ KABASAKAL
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyoloji, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Kocaeli Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 138

Özet

Escherichia coli membran proteini FtsH, AAA+ ATPaz ve metalloproteaz özelliklerine sahip, yanlış katlanmış veya hatalı proteinleri parçalayan bir proteindir. FtsH'nin proteolitik aktivitesi, HflKC tarafından düzenlenmektedir. Bu çalışma, FtsH-HflKC kompleksinin biyokimyasal karakterizasyonunu ve yapısal analizini içermektedir. FtsH-HflKC ve HflKC'nin rekombinant üretimi, Lemo21 (DE3) konak hücrelerinde optimize edilmiş, Streptaktin ve/veya Kobalt reçineleri kullanılarak saflaştırılmıştır. FtsH ve FtsH-HflKC'nin proteolitik deneyleri, ATP varlığı ve yokluğunda %0,4 kazein kullanılarak 574 nm'de 37 ve 50ºC'de gerçekleştirilmiştir. Buna göre 37°C'de ATP yokluğunda FtsH'nin bağıl aktivitesi %100, ATP varlığında %90 olarak belirlenmiştir. FtsH, HflKC ile kompleks oluşturduğunda 37°C'deki ATP varlığında ve yokluğunda bağıl proteolitik aktivitesi sırasıyla %39 ve %40 olarak tespit edilmiştir. Sonuçlar, HflKC'nin FtsH'nin proteolitik aktivitesinde düşüşe neden olduğunu göstermiştir. ATPaz aktiviteleri, farklı ATP konsantrasyonlarında 360 nm'de incelenmiştir. 2 µM FtsH ve FtsH-HflKC'nin 10 mM ATP varlığında spesifik aktiviteleri sırasıyla 9,97 U/mg ve 3,85 U/mg olarak hesaplanmıştır. Yapısal analizde, FtsH-HflKC, TEM, Kriyo-EM ve SAXS ile incelenmiştir. RELION 4.1 ve CryoSPARC programlarında FtsH-HflKC'nin üç boyutlu haritaları elde edilmiştir. İki boyutlu sınıflandırmada FtsH-HflKC'nin dinamik yapısını koruduğu gözlemlenmiştir. Bu nedenle, RELION 4.1'de yapı, FtsH ve HflKC olarak iki ayrı harita şeklinde işlenmiş, CryoSPARC'ta kompleks yapı bir tutularak algoritması esneklik üzerine olan Uniform Olmayan İyileştirme işlemi gerçekleştirilmiştir. C6 simetrisinde olduğu SAXS deneyleriyle desteklenen ve ~27 nm büyüklüğündeki kompleksin çözünürlükleri; RELION 4.1'de FtsH için 8,8 Å, HflKC için 9,32 Å; CryoSPARC'ta tüm yapı için 9,25 Å olarak belirlenmiştir. Harita, hekzamerik FtsH yapısının altı HflKC dimeriyle kompleks oluşturduğunu göstermektedir. Bu araştırma, antibiyotik direnciyle mücadelede önemli katkılar sunarak yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine yönelik fırsatlar sağlamaktadır.

Özet (Çeviri)

Escherichia coli membrane protein FtsH is an AAA+ ATPase and metalloprotease and cleaves misfolded proteins. Proteolytic activity of FtsH is regulated by HflKC. This study encompasses biochemical and structural analysis of FtsH-HflKC complex. Recombinant production of FtsH-HflKC and HflKC was optimized in Lemo21 (DE3) cells, purified using Streptactin and/or Cobalt resins. Proteolytic experiments of FtsH and FtsH-HflKC were conducted at 574 nm, using 0.4% casein, at 37 and 50°C, with and without ATP. At 37°C without ATP, FtsH exhibited a relative activity of 100%, while in presence of ATP, relative activity was 90%. Relative proteolytic activities of FtsH-HflKC were 39-40% in presence and absence of ATP, respectively. Results indicate that HflKC has down-regulatory effect on FtsH's proteolytic activity. ATPase activities were performed at 360 nm under different ATP concentrations. Specific activities of FtsH and FtsH-HflKC are found 9.97 U/mg and 3.85 U/mg, respectively. Structural analysis employed TEM, Cryo-EM, and SAXS for FtsH-HflKC. Three-dimensional maps were obtained using RELION 4.1 and CryoSPARC. Two-dimensional classification revealed dynamic structure preservation of FtsH-HflKC. Separate maps as FtsH and HflKC were generated in RELION 4.1, while in CryoSPARC, structure was processed as FtsH-HflKC. SAXS experiments confirming C6 symmetry, ~27 nm-sized particles have resolutions of 8.8Å for FtsH and 9.32Å for HflKC in RELION 4.1, and 9.25Å for the entire structure in CryoSPARC. Maps indicate formation of complex with a hexameric FtsH structure and six HflKC dimers. This research makes a significant contribution to combating antibiotic resistance by providing opportunities for the development of novel antibiotics.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    507715

    Kentsel atıksu arıtma tesisi anaerobik çamur çürütücülerinin dinamik proses modelleme yaklaşımı ile analizi

    Analysis with dynamic process modeling approach of anaerobic sludge digesters of the urban wastewater treatment plant

    KERİM EKİCİ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Çevre Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HAYRETTİN GÜÇLÜ İNSEL

  2. Tez No

    260942

    Assessment of hard tıssue densıty around dental ımplants usıng conventıonal radıographs

    Dental implantlar çevresindeki sert doku densitesinin konvensiyonel radyograflar ile incelenmesi

    WAEL ALSHAIBANI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Diş HekimliğiGazi Üniversitesi

    Ağız, Diş, Çene Hastalıkları ve Cerrahisi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NUR MOLLAOĞLU

  3. Tez No

    430918

    Contribution of DegP protease to the protein quality control in Escherichia coli

    DegP proteazinin Escherichia coli'de protein kalite kontrolüne olan katkisi

    YAPRAK ÖZAKMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyokimyaHacettepe Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SİBEL SÜMER

  4. Tez No

    785942

    Tahin-pekmez karışımlarının doğrusal olmayan reolojik davranışlarının incelenmesi

    Investigation of nonlinear rheological behaviors of tahini-molasses mixtures

    GÜLAY AKKAYA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FİLİZ ALTAY

  5. Tez No

    1149

    Büyük mum güvesi (Galleria mellonella L.) ya etkili Bacillus thuringiensis suşları ve bunların plazmid içerikleri üzerinde araştırmalar

    A Study of bacillus thuringiensis strains effected on creater max moth (Galleria mellonella L.) and their plasmids

    MUSTAFA AKÇELİK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1987

    MikrobiyolojiAnkara Üniversitesi

    Tarım Ürünleri Teknolojisi Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. M. LÜFTÜ ÇAKMAKÇI

Geri Dön