Development of a second-generation multi-epitope homologous virus-like particle (VLP)-based vaccine candidate against SARS-CoV-2 on a plant platform
SARS-CoV-2'ye karşı ikinci jenerasyon multi-epitoplu homolog virüs benzeri parçacık (VLP)-temelli aşı adayının bitki platformunda geliştirilmesi
- Tez No: 897015
- Danışmanlar: DOÇ. DR. CEYHUN KAYIHAN, DR. ÖĞR. ÜYESİ DOĞA SELİN KAYIHAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Başkent Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 194
Özet
Ağır akut solunum yolu sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)'nin neden olduğu koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisinin ciddi etkisi, dünya çapında çok çeşitli aşıların kullanılmasıyla hafifletilmiştir. Bununla birlikte, COVID-19 aşılarının adil dağıtımı, özellikle gelişmekte olan ve az gelişmiş ülkelerde zor olmaya devam etmektedir. SARS-CoV-2'ye karşı COVID-19 aşılarının hem üretiminde hem de uygulanmasında bugüne kadar gösterilen büyük çabalara rağmen, ortaya çıkan varyantları çapraz nötralize edebilen erişilebilir bir aşı geliştirilmesi önemini korumaktadır. Bu sebeple bu tezde, SARS-CoV-2'nin tüm yapısal proteinlerini içererek SARS-CoV-2'nin yapısına en yüksek benzerlikle geniş bir antijenite yelpazesi sergileyebilecek ve böylece ortaya çıkan varyantlara karşı koruma sağlayabilecek virüs benzeri partikül (VLP) tabanlı bir aşı adayının uygun maliyetli ve hızlı bir ekspresyon sistemi olan bitki platformunda üretilmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, SARS-CoV-2'nin yapısal proteinlerini [spike (S), membran (M), nükleokapsid (N) ve zarf (E)] kodlayan genler için ekspresyon kasetleri tasarlanmıştır. Hücresel kompartmanlaşmanın (endoplazmik retikulum; ER ve kloroplast; chl) ifade ürünlerinin seviyesi üzerindeki etkisini araştırmak için farklı sinyal dizileri eklenmiştir. Kodon optimizasyonunu takiben, gen kasetleri ticari olarak sentezlenmiştir. Gen kasetleri, bir bitki ekspresyon vektörü olan pEAQ-HT'ye ayrı ayrı başarıyla klonlanmıştır. İlgilenilen geni (GOI) taşıyan her plazmid elektroporasyon yoluyla Agrobacterium tumefaciens'e aktarılmıştır. Yaklaşık dört haftalık Nicotiana benthamiana bitkilerinin yaprakları bu plazmidleri taşıyan A. tumefaciens hücreleri aracılığıyla infiltre edilmiştir. Kontrol olarak, yapraklar pEAQ-HT-GFP içeren Agrobacterium hücreleri ile paralel olarak infiltre edilmiş ve GFP ışıması 3, 5 ve 7 gün sonra ultraviyole ışık altında görüntülenmiştir. GOI'lerin mRNA düzeyindeki ifadeleri ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile belirlenmiştir. Protein ifadesini göstermek için, toplam çözünür proteinler (TSP) yapraklardan izole edilmiş, Western blot ve ELISA analizleri için kullanılmıştır. Son olarak, VLP'ler çift katmanlı sükroz yastık ultrasantrifüjleme ile saflaştırılmış ve uygun antikorlar (anti-N ve anti-S) kullanılarak Western blot ve ELISA ile analiz edilmiştir. Bu tezde Agrobacterium ko-infiltrasyonlu yaprak örneklerinde tüm GOI'lerin mRNA ekspresyonları doğrulanmıştır. N proteini hem TSP hem de saflaştırılmış örneklerde Western blot ve ELISA analizleri ile tespit edilmiştir. Western blot bant yoğunluğu ve ELISA sonucuna göre N proteininin ekspresyon seviyesinin ER'ye hedeflenmiş örneklerde (VLP-ER), kloroplasta hedeflenmiş örneklere (VLP-Chl) göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma, SARS-CoV-2'nin tüm yapısal proteinlerini içeren VLP'lerin bitki bazlı üretiminin ilk gösterilişidir ve düşük maliyetli ve ölçeklenebilir bir COVID-19 aşısının geliştirilmesine yönelik önemli bir adım olarak kabul edilmektedir.
Özet (Çeviri)
The severe impact of the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has been mitigated using a wide range of vaccines worldwide. However, the equitable distribution of COVID-19 vaccines remains challenging, particularly in developing and underdeveloped countries. Despite the great efforts to date in both the production and administration of COVID-19 vaccines against SARS-CoV-2, developing an accessible vaccine that can cross-neutralize emerging variants remains important. Therefore, in this thesis, we aimed to produce a virus-like particle (VLP)-based vaccine candidate containing all the structural proteins of SARS-CoV-2 in plant platform, as a cost-effective and fast expression system, that may exhibit a broad range of antigenicity with the highest similarity to the structure of SARS-CoV-2, and thus may protect against emerging variants. Firstly, expression cassettes were designed for the genes encoding the structural proteins [spike (S), membrane (M), nucleocapsid (N), and envelope (E)] of SARS-CoV-2. To investigate the effect of cellular compartmentalization (endoplasmic reticulum; ER and chloroplast; chl) on the level of the expression products, different signal sequences were added. Following codon optimization, the gene cassettes were commercially synthesized. The gene cassettes were successfully cloned individually into a plant expression vector, pEAQ-HT. Each plasmid carrying the gene of interest (GOI) was transformed into Agrobacterium tumefaciens by electroporation. The leaves of approximately four-week-old Nicotiana benthamiana plants were co-infiltrated with Agrobacterium tumefaciens cells carrying these plasmids. As a control, leaves were infiltrated in parallel with pEAQ-HT-GFP containing Agrobacterium cells and visualized under ultraviolet light at 3-, 5-, and 7-days post-infiltration. The expressions of the GOIs at mRNA level were determined by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). To demonstrate protein expression, total soluble proteins (TSPs) were isolated from the leaves and used for Western blot and ELISA analyses. Finally, VLPs were purified by double-layer sucrose cushion ultracentrifugation and analyzed by Western blot and ELISA using appropriate antibodies (anti-N and anti-S). In this thesis, mRNA expressions of all the GOIs (S, S-chl, E, M N) were confirmed in the Agrobacterium co-infiltrated leaf samples. N protein was detected in both TSPs and the purified samples by Western blot and ELISA analyses. The expression of N protein was higher in ER-targeted samples (VLP-ER) than chloroplast-targeted samples (VLP-Chl) according to the Western blot band density and ELISA as well. This study is the first demonstration of plant-based production of VLPs containing all structural proteins of SARS-CoV-2 and is considered an important step towards the development of a low-cost and scalable COVID-19 vaccine.
Benzer Tezler
- Biyodizel tedarik zinciri ağ tasarımı için çok amaçlı karma tam sayılı doğrusal programlama modeli önerisi
Development of a multi-period mix integer linear programming model for biodiesel fuels supply chain
MELİKE SIRAKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Endüstri ve Endüstri Mühendisliğiİstanbul Ticaret ÜniversitesiEndüstri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. BERK AYVAZ
YRD. DOÇ. DR. ALİ OSMAN KUŞAKCI
- Development of high repetition rate Cr:LiCAF femtosecond lasers and application of multipass-cavity Ti:Sapphire lasers in THz generation
Yüksek tekrarlama frekanslı femtosaniye Cr:LiCAF lazerlerinin geliştirilmesi ve çok yansımalı Ti:Safir lazerinin THz radyasyonu üretimindeki uygulaması
CAN CIHAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Elektrik ve Elektronik MühendisliğiKoç ÜniversitesiPROF. DR. ALPHAN SENNAROĞLU
- Karma geliştirme projeleri ve programlama ilkeleri
Mixed-use development projects and their programming principles
GÖKHAN AKTAN ALTUĞ
- Trakya havzası doğal gaz değerlendirilmesi
Başlık çevirisi yok
GÜLTEKİN ÇINAR
Yüksek Lisans
Türkçe
1996
Petrol ve Doğal Gaz Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiPROF.DR. ABDURRAHMAN SATMAN
- Lageos I ve lageos II için doğruluk analizi
Başlık çevirisi yok
GAYE KIZILSU
Doktora
Türkçe
1998
Jeodezi ve Fotogrametriİstanbul Teknik ÜniversitesiÖlçme Tekniği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUHAMMET ŞAHİN