Generating an Orthogonal tRNA Suppressor of Pyrococcus horikoshii in Escherichia coli
Escherichia coli'de Pyrococcus horikoshii'nin Ortogonal tRNA Baskılayıcısının Oluşturulması
- Tez No: 934059
- Danışmanlar: PROF. DR. XAVIER GOMIS-RÜTH
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Pompeu Unıversıty Fabra (upf)
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Sağlık Bilimleri Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Geçtiğimiz yirmi yılda E. coli'deki genetik kodu genişletmek için farklı teknikler kullanılmıştır. Kanonik olmayan amino asitleri (NCAA'lar) bir rekombinant proteinin belirli pozisyonlarına dahil etmek için kullanılan tekniklerden biri, amber durdurma kodonunun bir ortogonal aminoasil-tRNA sentetaz/tRNA baskılayıcı çifti (aaRS/tRNAcua) ile kombinasyonudur. E. coli'de belirli pozisyonlara 150'den fazla NCAA'yı dahil etmek için farklı ortogonal çiftler başarıyla kullanılmıştır. Projenin amacı, E. coli'deki lösine benzer NCAA'yı dahil etmek üzere Pyrococcus horikoshii'nin lösilRS/LeutRNAcua'sının (phleucylRS/phLeutRNAcua) ortogonal bir çiftini oluşturmaktır. Bu nedenle ilk amaç, phleucylRS'nin ortogonal olup olmadığını belirlemek ve E. coli'de (phleutRNAcua) P. horikoshii'nin ortogonal bir tRNA baskılayıcısını oluşturmaktır. Grubumuzun önceki çalışmaları, phleutRNAcua'nın E. coli LeuRS tarafından yüklenebileceğini ve bunun bizim amacımız için kullanılamayacağını öne sürdüğünü göstermiştir. Sonuç olarak, ortogonal bir phleutRNAcua gereklidir. Ortogonal bir phleutRNAcua mutantını bulmak için bir phleutRNAcua mutant kütüphanesi oluşturulmuştur. Mutant kütüphanenin negatif seçimi, toksik barnaz genindeki amber kodonunun baskılanması kullanılarak yapılmıştır. Hayatta kalan koloniler ya ortogonal ya da işlevsel olmayan baskılayıcı phleutRNAcua içermektedir, dolayısıyla amber durdurma kodonunun E. coli'de phLeuRS ekspresyonuyla bir kloramfenikol (Cm) direnç genine dönüştürülmesi testi olarak düşünüldüğünde pozitif seçimle daha fazla test edilmeleri gerekmektedir. Sonuç olarak E. coli'de phleutRNAcua'nın pozitif seçimi için gerekli olan amber kodonlu ve phLeuRS'li Cm direncini içeren vektör yapımı yapılmıştır. Projenin bir sonraki adımı, daha sonra NCAA'ların dahil edilmesi için kullanılabilecek phleutRNAcua mutantlarını tanımlamak amacıyla bu yeni yapıyı kullanmak olacaktır.
Özet (Çeviri)
Over the past two decades, different techniques have been used to expand the genetic code in E. coli. One of the techniques used to incorporate noncanonical amino acids (NCAAs) in specific positions of a recombinant protein is the combination of the amber stop codon with an orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA suppressor pair (aaRS/tRNAcua). Different orthogonal pairs have been successfully used to incorporate more than 150 NCAAs in specific positions in E. coli. The project aims to generate an orthogonal pair of the leucylRS/LeutRNAcua of Pyrococcus horikoshii (phleucylRS/phLeutRNAcua) to incorporate NCAA similar to leucine in E. coli. Therefore, the first goal is to determine if the phleucylRS is orthogonal and to generate an orthogonal tRNA suppressor of P. horikoshii in E. coli (phleutRNAcua). Previous studies from our group demonstrate that the phleutRNAcua, can be charged by E. coli LeuRS, suggesting that it cannot be used for our purpose. Consequently, an orthogonal phleutRNAcua is required. A phleutRNAcua mutant library has been generated to find an orthogonal phleutRNAcua mutant. Negative selection of the mutant library was done using suppression of amber codon in the toxic barnase gene. The survivor colonies contain either orthogonal or nonfunctional suppressor phleutRNAcua, thus, they must be further tested by positive selection, through the test of the amber stop codon into a chloramphenicol (Cm) resistance gene with the expression of the phLeuRS in E. coli. Consequently, constructing a vector containing Cm resistance with amber codons and the phLeuRS was made which is required for the positive selection of the phleutRNAcua in E. coli. The project's next step will be to use this new construct to identify the mutants of phleutRNAcua that can be used later for NCAAs incorporation.
Benzer Tezler
- Hızlı frekans hoplamalı dik frekans bölmeli çoğullama sisteminin sönümlemeli kanallardaki başarım analizi
The performance analysis of fast frequency hopping orthogonal frequency division multiplexing system over fading channels
AHMET OTURAK
Doktora
Türkçe
2017
Bülent Ecevit ÜniversitesiElektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Yükleniyor...
- İki değişkenli sonlu ortogonal polinom aileleri ve bazı özellikleri
Finite classes of orthogonal polynomials in two variables and some properties
ESRA GÜLDOĞAN LEKESİZ
- Küçük uyduların vektör ölçümlerine dayalı arıza toleranslı yönelim belirleme sistemlerinin geliştirilmesi
Analysis of attitude determination motions of small satellites according to vector measurements
HANDE BODUR