BIOPHYSICAL STABILITY EVALUATION OF A VACCINE CANDIDATE CONTAINING PA, EF, AND LF TOXINS AND CONFORMATIONAL STUDIES ON RECOMBINANT PROTECTIVE ANTIGEN
PA, EF VE LF TOKSİNLERİNİ İÇEREN BİR AŞI ADAYININ BİYOFİZİKSEL STABİLİTESİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ VE REKOMBİNANT KORUYUCU ANTİJEN ÜZERİNE KONFORMASYONEL ÇALIŞMALAR
- Tez No: 945037
- Danışmanlar: PROF. DR. ELİF DAMLA ARISAN, PROF. DR. ŞEBNEM ERÇELEN CEYLAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Bacillus anthracis, Şarbon, Bacillus anthracis, Anthrax
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bacillus anthracis, şarbon olarak bilinen akut ve çoğunlukla ölümcül seyreden bir enfeksiyona neden olan, gram-pozitif, çubuk şeklinde, spor oluşturan zoonotik bir bakteridir. Konak organizmayı enfekte etmesiyle birlikte bakteri, hücresel homeostazı bozan ve hücre ölümüne yol açan koruyucu antijen, letal faktör ve ödem faktörü de dahil olmak üzere üç ana ekzotoksin salgılar. B. anthracis, sporlarının aerosolleşme kolaylığı nedeniyle halk sağlığı açısından ciddi bir tehdit oluşturduğundan birinci seviye patojen olarak sınıflandırılmış ve kategori A biyo-terörizm etmeni olarak tanımlanmıştır. Antibiyotikler ve antitoksinler gibi çeşitli tedavi yöntemleri mevcut olsa da, şarbona karşı en temel ve kolay önleme stratejisi halen aşılamadır. Yıllar içinde aşı teknolojilerinde yaşanan gelişmeler farklı türlerde şarbon aşılarının geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Her ne kadar bağışıklamanın başarısı büyük ölçüde aşının etkinliğine bağlı olsa da, formülasyonların stabilitesi aşının kalitesi ve etkinliğini doğrudan etkilediği için kritik bir unsurdur. Bu nedenle, yeni formülasyonların stabilitesi ve raf ömrünün titizlikle değerlendirilmesi önem arz etmektedir. Aşı stabilitesinin değerlendirilmesi, aşıların ruhsatlandırma süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada, PA, EF ve LF toksinlerini içeren aday bir aşının +4 °C'de (soğukta) ve +25 °C'de (oda sıcaklığında) bir yıl boyunca depolanmış formlarının biyofiziksel stabilite değerlendirmesinin yapılması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, seyreltilmemiş hücre içermeyen şarbon aşısı ve dört alt seyreltisi (1/4, 1/16, 1/64 ve 1/256) için parçacık boyutu, zeta potansiyeli, polidispersite indeksi, pH, antijen desorpsiyonu ve antijen bütünlüğü gibi kilit stabilite göstergeleri izlenmiştir. Antijenlerin yapısal bütünlüğü genel aşı etkinliği için hayati öneme sahip olduğundan ve küçük yapısal bozulmalar immünojenisiteyi etkileyebileceğinden, rPA'ya +45 °C'de ısı kaynaklı stres uygulanmıştır. Ardından, yapısal değişiklikleri incelemek amacıyla intrinsik triptofan floresansı ve ekstrinsik ANS floresansı gibi biyofiziksel teknikler kullanılmıştır. Dinamik ve elektroforetik ışık saçılımı kullanılarak yapılan bir yıllık biyofiziksel stabilite izlemesinde, 1/4 ve 1/16 seyreltik formülasyonların her iki depolama koşulunda da, orta düzeyde parçacık boyutu ve elektrostatik itmeyle birlikte düşük polidispersite indeksi ile diğerlerine kıyasla daha üstün biyofiziksel stabilite gösterdiği ortaya konmuştur. Western blot analizleri, alum içeren aşı formülasyonlarından antijen desorpsiyonunun hem depolama süresi hem de sıcaklıktan güçlü şekilde etkilendiğini göstermiştir. Uzun süreli saklama ve oda sıcaklığında depolama, antijenin ekstrakte edilmesini zorlaştırarak düşük verime ve bozulmuş yapısal bütünlüğe yol açmaktadır. Ayrıca, aşı koruyucularının da antijen desorpsiyonunu olumsuz etkilediği bulunmuştur. Konformasyonel çalışmalar, ısı stresi altında rPA'nın intrinsik triptofan floresansında kademeli bir azalma olduğunu ve 60 dakika içinde emisyon maksimumunda kırmızıya kayma meydana geldiğini göstermiştir. Bu da, proteinin hidrofobik çekirdeğinde gömülü olan triptofan kalıntılarının yapısal bozulmalar nedeniyle çözücüye maruz kaldığını düşündürmektedir. ANS floresansındaki artış ve gözlenen maviye kayma, hidrofobik kısımların çözücüye maruz kalmasının ek bir göstergesi olarak, rPA'nın ısı stresine verdiği iki aşamalı tepkiyi ortaya koymuştur: önce açılma ardından agregasyon. Bu bulgular, aşı formülasyonlarının stabilitesine dair kritik biyofiziksel ve yapısal özellikleri ortaya koyarak konuya dair daha derin bir anlayış sağlamaktadır. Gelecekteki çalışmalar, aşı stabilitesini daha da artırmak ve aşının etkinliğini raf ömrü boyunca korumak adına formülasyon bileşenlerinin, parametrelerinin ve depolama koşullarının optimize edilmesine odaklanmalıdır.
Özet (Çeviri)
Bacillus anthracis is a gram-positive rod-shaped spore-forming zoonotic bacterium that causes an acute and often deadly infection known as anthrax. Upon infecting host organism, the bacterium secretes three key exotoxins including protective antigen, lethal factor and edema factor that together disrupt cellular homeostasis and lead cell death. B. anthracis is categorized as tier 1 pathogen and recognized as category A bioterrorism agent due to ease of aerosolization of its spores, which poses an extreme threat to public health and requires special preparedness. Despite the availability of various therapeutic approaches such as antibiotics and antitoxins, vaccination still remains the most fundamental and facile strategy preventing anthrax. Over the years, advancements in vaccine technologies have enabled the development of different forms of anthrax vaccines. Although the success of immunization heavily depends on the vaccine efficacy, stability of formulations is critical issue as it directly influences vaccines' quality and potency. Therefore, it is crucial to rigorously assess the stability and shelf life of novel formulations. The evaluation of vaccine stability also plays a critical role in the vaccines' licensing processes. In this study, it is aimed to perform biophysical stability evaluation of a vaccine candidate containing PA, EF and LF toxins which were stored in refrigerated (+4 °C) and ambient (+25 °C) conditions over a one-year period. In this direction, key stability-indicating parameters including particle size, zeta potential, polydispersity index, pH, antigen desorption and antigen integrity were monitored in an undiluted cell-free anthrax vaccine and its four sub-dilutions (1/4, 1/16, 1/64 and 1/256 diluted formulations). Since the structural integrity of antigens is crucial for overall vaccine efficacy and minor structural perturbation may affect the immunogenicity, rPA was exposed to thermal-induced stress at +45 °C. Subsequently, biophysical techniques like intrinsic tryptophan fluorescence and extrinsic ANS fluorescence were employed to investigate the structural changes in rPA. One year follow-up of biophysical stability parameters using dynamic and electrophoretic light scattering revealed that 1/4 and 1/16 diluted vaccine formulations exhibited superior biophysical stability, characterized by moderate particle size and electrostatic repulsion along with lower polydispersity index among other formulations under both storage conditions. Western blot analyses demonstrated that antigen desorption from alum-containing vaccine formulations is strongly influenced by both storage time and temperature indicating that prolonged storage and storage at ambient temperatures impede antigen extraction resulting in poor yield and compromised structural integrity. In addition, vaccine preservatives were found to have a negative impact on antigen desorption. Conformational studies highlighted that thermal stress led to a progressive decline in intrinsic tryptophan fluorescence of rPA, accompanied by a red shift in emission maxima within 60 minutes, suggesting that tryptophan residues originally buried at the hydrophobic core of the protein became solvent-exposed due to structural perturbations. The increased ANS fluorescence and the observed blue shift provided additional evidence of solvent exposure of hydrophobic residues, indicating a biphasic response of rPA to heat stress, characterized by initial unfolding and subsequent aggregation. These findings contribute to a deeper understanding of the stability of vaccine formulations by revealing critical biophysical and structural characteristics. Future studies should focus on optimizing formulation components, parameters and storage conditions to further improve vaccine stability ensuring consistent potency.
Benzer Tezler
- Biointerfacial mechanical modulation of model lipid membranes by gramicidin D: A quartz crystal microbalance with dissipation analysis
Gramisidin D'nin model lipid membranlarda biyoarayüzeysel mekanik modülasyonunun disipasyonlu kuvars kristal mikroterazi analizi
ŞEBNEM SEHERLER
Doktora
İngilizce
2026
İstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
Yükleniyor...
- DE NOVO FRATAXİN PROTEİNİ TASARIMI: KATLANMA MOTİFLERİ, METAL İYON BAĞLANMA BÖLGELERİ, MOLEKÜLER DOCKİNG VE MOLEKÜLER DİNAMİK SİMÜLASYONLAR İLE OPTİMAL STABİLİTE İÇİN YAPAY ZEKÂ DESTEKLİ YAKLAŞIMLAR
DE NOVO FRATAXIN PROTEIN DESIGN: AI-ASSISTED APPROACHES FOR OPTIMAL STABILITY THROUGH FOLDING MOTIFS, METAL ION BINDING SITES, MOLECULAR DOCKING AND MOLECULAR DYNAMICS SIMULATIONS
KEVSER KÜBRA KIRBOĞA
- Atopik dermatit tedavisine yönelik topikal nano ilaç taşıyıcı sistemlerin optimizasyonu, ın vitro/ın vivo değerlendirilmesi
Optimization of nano-sized topical drug carriers for treatment of atopic dermatitis, in vitro/in vivo evaluation
SİNEM GÜNGÖRDÜK
- Doğal protein katkılı biyobozunur polimer doku matrikslerinin geliştirilmesi ve adipoz kök hücreler ile etkileşiminin araştırılması
Evaluation of biodegradable polymeric scaffolds with natural protein and interaction with adipose derived stem cells
NERGİS ZEYNEP RENKLER DEĞİRMENCİ
- Cam fiber ve zirkonyum seramik postların üç farklı adeziv siman kullanılarak, tek köklü dişlerde simantasyonu sonucu oluşan mikrosızıntının karşılaştırılmalı olarak incelenmesi
The comparative study of microleakage which is a result of cementation in single rooted teeth restored with glass-fiber and zirconium ceramic posts using three different adhesive resin cements
RAMİZ CAN ERBAŞAR
