Hemoglobin beta zincirinin E. coli'de rekombinant ekspresyonu: ideal ekspresyon koşullarının belirlenmesi ve fonksiyonel protein üretimi
Recombinant expression of hemoglobin beta chain in E. coli: determination of ideal expression conditions and production of functional protein
- Tez No: 998088
- Danışmanlar: PROF. DR. SUAT ERDOĞAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Tıbbi Biyoloji, Biyoteknoloji, Genetics, Medical Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Trakya Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Hemoglobin beta alt birimi (beta-globin, HBB), 147 amino asit uzunluğunda ve 16 kDa moleküler ağırlığına sahip bir globin proteinidir. HBB geni tarafından kodlanan bu protein, alfa-globin ile ikişer alt birimden oluşarak yetişkin insanlarda en yaygın hemoglobin formu olan hemoglobin A'yı oluşturur. Hemoglobin, kırmızı kan hücrelerinde bulunan ve akciğerlerden dokulara oksijen taşımakla görevli önemli bir proteindir. Bu çalışma, insan hemoglobin beta (HBB) zincirinin Escherichia coli (E. coli) ekspresyon sisteminde rekombinant olarak üretilmesi ve saflaştırılması için gerekli koşulların optimize edilmesini amaçlamıştır. HBB proteinini kodlayan plazmid E. coli BL21 (DE3) suşuna CaCl2 yöntemi kullanılarak aktarıldı, kanamisin dirençli koloniler seçilerek kültürleri sağlandı, ifadeleme yapan kolonilerin yapılan kültür optimizasyonlarına göre zengin besi ortamında ve 0.25 mM IPTG varlığında yüksek düzeyde inklüzyon cisimciği tarzında çözünmez formda HBB ifade ettiği saptandı. Sonikasyon ile parçalanan bakterilerden santrifüj ile inklüzyon cisimciği formundaki HBB ayrıştırıldı. Çözünmez yapıdaki HBB yapılan analizlerde 2 M üre ve % 1 sarkozil karışımında büyük oranda çözdürülebildiği yapılan SDS-PAGE analizi ile gösterildi. Üretilerek rekombinant HBB proteini taşıdığı His-tag etiketinden Ni-NTA reçinesine bağlanarak afinite kromatografi kullanılarak saflaştırıldı. Elütlerden yapılan SDS-PAGE, Western blot ve MALDI-TOF kütle spektrometresi analizleri ile protein karakterize edildi. Bu tez kapsamında edilen sonuçlara göre, rekombinant HBB proteini E. coli ekspresyon sistemi ile yüksek saflıkta üretilebileceği ve farklı tanı platformlarında pozitif kontrol veya kalibrasyon materyali olarak kullanım potansiyeli bulabileceği ortaya konulmuş oldu.
Özet (Çeviri)
The hemoglobin beta subunit (beta-globin, HBB) is a globin protein consisting of 147 amino acids with a molecular weight of approximately 16 kDa. This protein, encoded by the HBB gene, combines with two alpha-globin subunits to form hemoglobin A, the most prevalent form of hemoglobin in adult humans. Hemoglobin is a critical protein found in red blood cells and is responsible for transporting oxygen from the lungs to peripheral tissues. The aim of this study was to optimize the conditions required for the recombinant production and purification of the human hemoglobin beta (HBB) chain using the Escherichia coli (E. coli) expression system. The plasmid encoding the HBB protein was introduced into E. coli BL21 (DE3) cells using the CaCl₂ method, and kanamycin-resistant colonies were selected and cultured. Based on culture optimization experiments, it was determined that HBB was expressed at high levels predominantly in an insoluble inclusion body form in rich medium in the presence of 0.25 mM IPTG. Inclusion body–associated HBB was separated by centrifugation following bacterial cell disruption via sonication. SDS-PAGE analysis demonstrated that the insoluble HBB protein could be largely solubilized using a mixture of 2 M urea and 1% sarkosyl. The recombinant HBB protein was purified by affinity chromatography through binding of its His-tag to Ni-NTA resin. The purified protein was subsequently characterized by SDS-PAGE, Western blotting, and MALDI-TOF mass spectrometry analyses of the eluted fractions. According to the results obtained in this thesis, recombinant HBB protein can be produced with high purity using the E. coli expression system, and it exhibits potential for use as a positive control or calibration material in various diagnostic platforms.
Benzer Tezler
- Beta talasemi minörde serum ürotensin II düzeyi incelenmesi
Başlık çevirisi yok
ŞEBNEM BURHAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
HematolojiBezm-İ Alem Vakıf Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUHARREM KISKAÇ
- Beta talasemi minörde serum endokan düzeyi
Serum endocan levels in beta thalassemia minor
NIJAT KHANMAMMADOV
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2019
HematolojiBezm-İ Alem Vakıf Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ZORLU
- Detection of the red blood cell adhesion to the vascular endothelium using microfluidic chip in beta thalassemia patients
Beta talasemi hastalarında mikroakışkan çip kullanılarak kırmızı kan hücrelerinin vasküler endotele yapışmasının tespiti
NESLİHAN ÇİLEK
Doktora
İngilizce
2024
Moleküler TıpKoç ÜniversitesiTıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. ÖZLEM YALÇIN SEYHAN
- Kemik iliği transplantasyonu yapılan beta talasemi majör tanılı hastalarda alfa gen mutasyonlarının etkisi
The effect of alpha gene mutations on bone marrow transplantation defined with beta thalassemia major
GİZEM ÖZCAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıEge ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SAVAŞ KANSOY
- HBA1C ölçümünde HPLC, LC/ESI/MS ve immün assay yöntemlerinin karşılaştırılmaı
Measurement of HBA1C HPLC, Immunoassay and LC/ESI/MS comparison of methods
MAHMUT AYDIN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2014
BiyokimyaMersin ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET BURAK YAVUZ ÇİMEN