Dolaşan tümör DNA'larının PNA-temelli platformlar ile tayini
Determination of circular tumor dna with PNA-based platforms
- Tez No: 1004878
- Danışmanlar: PROF. DR. ADİL DENİZLİ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Biyosensörler, Tek nükleotid polimorfizmi, Biosensors, Single nucleotide polymorphism
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu tez çalışmasında, peptit nükleik asit (PNA) probu kullanılarak, altın nanoparçacıkların (AuNP) ve gümüş nanoparçacıkların (AgNP) agregasyonuna dayalı yeni kolorimetrik tek baz polimorfizmi (SNP) tespit yöntemleri geliştirilmiştir. Hedef DNA dizisi olarak PIK3CA geninde bulunan E545K mutasyonu seçilmiştir. Geliştirilen yöntemler, etiketleme ve immobilizasyon adımlarına gerek kalmaksızın, düşük maliyetli, hızlı ve ekipman gerektirmeyen analiz platformları sunmaktadır. Çalışmada, PNA probu ile tam tamamlayıcı DNA dizileri arasında oluşan hibritler, nanoparçacıkların agregasyonunu engellemiş; böylece çözeltinin karakteristik rengini koruması sağlanmıştır. Tek baz uyumsuz ya da tamamlayıcı olmayan dizilerin varlığında ise hibridizasyon yetersiz kalmış ve nanoparçacık agregasyonu gözlenmiştir. AuNP sistemi için, Turkevich yöntemi ile sentezlenen nanoparçacıklar (ortalama çap 24,5 ± 3,7 nm) kullanılmış ve sistem tek baz ayrımı yapabilecek düzeyde yüksek özgüllük sergilemiştir. PNA konsantrasyonu optimizasyonu sonucunda 10-20 pmol PNA kullanımının optimal olduğu belirlenmiştir. Sistemin limit of detection (LOD) değeri hedef DNA için 40 pM, tek baz mutasyonu taşıyan DNA için ise 8 pM olarak hesaplanmıştır. AgNP sistemleri için iki farklı sentez yöntemi (NaBH₄ indirgemesi ve sitrat/NaBH₄ ko-indirgemesi) uygulanmış ve karakterize edilmiştir. AgNP-4 örneği (sitrat/NaBH₄ ko-indirgemesi ile üretilen, ortalama çap 47,26 ± 7,07 nm, zeta potansiyeli -22,97 ± 3,58 mV) en kararlı sistem olarak belirlenmiştir. AgNP temelli sistemde de benzer özgüllük ve duyarlılık değerleri elde edilmiştir. Her iki sistemde de, farklı tuz konsantrasyonlarının (50, 100 ve 150 mM NaCl) agregasyon üzerindeki etkileri sistematik olarak incelenmiştir. 100 mM NaCl içeren hibridizasyon ortamının optimal koşulları sağladığı belirlenmiştir. UV-Vis spektrofotometresi ile yapılan analizlerde, AuNP için 520 nm ve 640 nm'de, AgNP için ise 420 nm ve 620 nm'de karakteristik absorbans tepe noktaları gözlenmiş; agregasyon durumunda bu tepelerde kayma ve şiddet değişimleri tespit edilmiştir. Sonuçlar OD₆₄₀/OD₅₂₀ (AuNP için) ve OD₆₂₀/OD₄₂₀ (AgNP için) oranları ile nicel olarak değerlendirilmiştir. Dinamik ışık saçılımı (DLS) ve zeta potansiyeli ölçümleri ile agregasyon durumları doğrulanmış, TEM analizleri ile nanoparçacık boyut dağılımları ve morfolojileri karakterize edilmiştir. Biyolojik matris çalışmalarında (%10 hücre lizatı ve %50 periferal kan), matris kaynaklı proteinlerin PNA-nanoparçacık etkileşimini olumsuz etkilediği ve sistemin bu ortamlarda etkinliğinin azaldığı gözlenmiştir. Bu durum, klinik uygulamalarda ön saflaştırma adımlarının gerekliliğini ortaya koymuştur. Geliştirilen kolorimetrik sistemler, düşük maliyetli, kullanımı kolay ve sahaya uyarlanabilir yapıları sayesinde SNP temelli genetik analizlerde umut vadeden tanı araçları olma potansiyeli göstermektedir. Özellikle kaynak kısıtlı ortamlarda ve hızlı tanı gerektiren durumlarda kullanılabilecek bu yöntemler, kişiselleştirilmiş tıp uygulamalarına katkı sağlayabilecek niteliktedir.
Özet (Çeviri)
In this thesis study, novel colorimetric methods based on the aggregation of gold nanoparticles (AuNPs) and silver nanoparticles (AgNPs) mediated by peptide nucleic acid (PNA) probes were developed for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs). The E545K mutation within the PIK3CA gene was selected as the target DNA sequence. The developed methods offer low-cost, rapid, and equipment-free platforms without requiring any labeling or immobilization steps. In these systems, hybridization between the PNA probe and the fully complementary target DNA prevented the aggregation of nanoparticles, thereby maintaining the characteristic color of the solution. In the presence of single-base mismatched or non-complementary sequences, insufficient hybridization led to aggregation and a visible color change. For the AuNP system, nanoparticles synthesized by the Turkevich method (average diameter 24.5 ± 3.7 nm) were used, and the system demonstrated high specificity for single nucleotide discrimination. PNA concentration optimization revealed that 10-20 pmol PNA was optimal. The limit of detection (LOD) values were calculated as 40 pM for target DNA and 8 pM for single-base mismatched DNA. For AgNP systems, two different synthesis methods (NaBH₄ reduction and citrate/NaBH₄ co-reduction) were applied and characterized. AgNP-4 sample (produced by citrate/NaBH₄ co-reduction, average diameter 47.26 ± 7.07 nm, zeta potential -22.97 ± 3.58 mV) was determined as the most stable system. Similar specificity and sensitivity values were obtained with the AgNP-based system. In both systems, the effects of different salt concentrations (50, 100, and 150 mM NaCl) on aggregation were systematically investigated. The hybridization medium containing 100 mM NaCl was found to provide optimal conditions. UV-Vis spectrophotometric analysis showed characteristic absorbance peaks at 520 nm and 640 nm for AuNP, and at 420 nm and 620 nm for AgNP; shifts and intensity changes in these peaks were detected upon aggregation. Results were quantitatively evaluated using OD₆₄₀/OD₅₂₀ (for AuNP) and OD₆₂₀/OD₄₂₀ (for AgNP) ratios. Aggregation states were confirmed by dynamic light scattering (DLS) and zeta potential measurements, while nanoparticle size distributions and morphologies were characterized by TEM analysis. In biological matrix studies (10% cell lysate and 50% peripheral blood), matrix-derived proteins negatively affected PNA-nanoparticle interactions, reducing system effectiveness in these environments. This finding highlighted the necessity of pre-purification steps for clinical applications. The developed colorimetric systems show promise as diagnostic tools in SNP-based genetic analysis due to their simplicity, cost-effectiveness, and suitability for point-of-care applications. These methods, particularly suitable for resource-limited settings and rapid diagnosis requirements, have the potential to contribute to personalized medicine applications.
Benzer Tezler
- Liquid biopsy analysis in Glioma: Pre-operative detection of IDH1, IDH2 and tert gene mutations in circulating free tumor DNA
Glıoma'da likit biyopsi analizi: Kanda dokaşan serbest tümör DNA'sındaki IDH1, IDH2 ve tert gen mutasyonlarının pre-operatif tespiti
MAİDE NUR PAKSOY
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
GenetikBahçeşehir ÜniversitesiSağlık Bilimleri Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ TİMUÇİN AVŞAR
- Circulating nucleic acid (CNA) separation from serum by electrospun membranes
Kanda serbest halde dolaşan nükleik asitlerin elektroeğirme lifler ile serumdan ayrılması
TUĞBA ISIK
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Polimer Bilim ve Teknolojisiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüMalzeme Bilimi ve Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA MUAMMER DEMİR
YRD. DOÇ. DR. NESRİN HORZUM POLAT
- Akciğer kanseri hastalarında Likit Biyopsi yönteminin hastalık tanısı üzerine etkinliğinin araştırılması
Investigation of the efficacy of Liquid Biopsy method on the diagnosis of lung cancer patients
MALİKE İNCE
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
GenetikKocaeli ÜniversitesiTıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NACİ ÇİNE
DR. ÖĞR. ÜYESİ SEDA EREN KESKİN
- Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) yolağıyla ilişkili, eksozomal miRNA'ların, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) olgularında araştırılması
Investigation of epidermal growth factor receptor (EGFR) pathway related exosomal miRNAs in non-small cell lung cancer (NSLC) cases
ALTUĞ KOÇ
- Development of rapid and accurate IDH1 mutation detection system that is compatible for intraoperative diagnosis
İntraoperatif tanı kullanımına yönelik, hızlı ve hassas IDH1 mutasyonu teşhis sistemi geliştirilmesi
ALİHAN SÜRSAL
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Moleküler TıpBahçeşehir ÜniversitesiSinir Bilimi Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ TİMUÇİN AVŞAR