HOK ifadesi tarafından tetiklenen ve split turboID yardımıyla izlenen çekirdek ile mitokondri arasındaki etkileşimin takip edilmesi
Crosstalk between nucleus and mitochondria induced by HOK expression and monitored by split turboID- aided biotinylation
- Tez No: 1007679
- Danışmanlar: PROF. DR. GÜRLER AKPINAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Kocaeli Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Amaç: Mitokondriler, hücrede sadece hücresel enerjiyi sağlayan organeller değildir; aynı zamanda ara metabolizmanın, kalsiyum tamponlamanın ve apoptoz (programlı hücre ölümü) gibi süreçlerin birçok yönünü de düzenlerler. Bu düzenleme görevini çekirdek ile sürekli olarak kurduğu sinyaller yolula iletişim halinde yapar. Mitokondri ve çekirdek arasındaki iletişim, hücresel homeostazın korunması ve strese adaptasyon için temel bir gerekliliktir. Çekirdek, anterograd sinyallerle mitokondriyal biyogenezi ve aktiviteyi kontrol ederken; mitokondri, enerji seviyelerindeki, ROS üretimindeki veya protein katlanmasındaki değişiklikleri algılayarak retrograd sinyallerle çekirdeği uyarır. Mitokondriyal hasar ve stres koşullarında aktive olan mitofaji, yalnızca bozulmuş mitokondrilerin uzaklaştırılmasını sağlayan bir kalite kontrol mekanizması olmakla kalmaz, aynı zamanda hücresel adaptasyonun koordinasyonu için çekirdekle çift yönlü bir iletişim sürecini de tetikler. Mitofaji sürecinin başlatılmasıyla birlikte mitokondri kaynaklı sinyaller, retrograd sinyalleme mekanizmaları aracılığıyla çekirdeğe iletilerek stres yanıt genlerinin ekspresyonunu ve nükleer protein bileşimini yeniden düzenler. Bu çalışmada, mitokondri ile çekirdek arasındaki iletişimi, protein bazında göstermeyi amaçladık. Bu amaç doğrultusunda mitokondriyal stresi kontrol ederek, Split TurboID yöntemi ile izlenebilir bir çekirdek proteomu olanağı sunan bir hücre hattı oluşturmayı hedefledik. Yöntem: Bu tez çalışmasında, hücre çekirdeğine yönlendirilmiş Split TurboID enzimi kullanılarak yakınlık-işaretleme sistemi ile çekirdek proteomunun izlenebilir özelliği içeren hücreler kullanıldı. Bu hücre hattına, kontrollü HOK proteinini ifade eden plazmit transfeksiyon yöntemiyle aktarılarak mitokondriyal stres indüksiyonu sağlanmıştır. Pozitif koloninin seçilebilmesi için immünfloresan mikroskopi yöntemi kullanılmıştır. Tetrasiklin ile indüklenen hücrelere Rapamisin eklenerek biyotinilasyon reaksiyonu kurulmuştur. Yapılan protein izolasyonunun ardından izole edilen proteinler streptavidin-kaplı manyetik boncuklar ile zenginleştirilerek çekirdek proteomu elde edilmiştir. Biyotinilasyon ve zenginleştirme aşamaları western blot analizleri ile doğrulanmıştır. Zenginleştirilen proteinler tripsin ile kesilerek peptitlere dönüştürülmüş ve nLC-MS/MS analizine tabi tutularak protein tanımlamaları yapılmıştır. Bulgular: LC-MS/MS analizi sonucunda tanımlanan toplam proteinler 8 saatlik tetrasiklin indüksiyonu sonrası Hok(-) çalışma grubunda 1152 iken Hok(+) çalışma grubunda ise 1252 olarak tespit edilmiştir. Tanımlanan bu proteinlerin içerisinde, 8 saatlik tetrasiklin indüksiyonu sonrası Hok(-) çalışma grubunda 726 iken Hok(+) çalışma grubunda ise 861 proteinin çekirdekte lokalize olduğu tespit edilmiştir. Bu doğrultuda Hok(+) çalışma grubu ile Hok(-) çalışma grubuna ait 8. Saat örnekleri, LFQ ile kıyaslandı. Elde edilen verilere bakıldığında Hok(+) grubunda 85 mitokondriyal proteinin arttığı, 80 mitokondriyal proteinin ifadesinde ise azalma olduğu görülmüştür. Sonuç: Hok-GFP ekspresyonunun indüklenmesi, mitokondriyal depolarizasyona ve ağ bütünlüğünün bozulmasına yol açarak hücresel düzeyde gözlenebilir bir stres yanıtı oluşturmuştur. Split-TurboID temelli karşılaştırmalı nükleer proteom analizi, mitokondri nükleus çapraz konuşmasında görev alan özgün proteinlerin belirlenmesini sağlamıştır. Bu hücresel model, mitokondri-çekirdek etkileşimlerini gerçek zamanlı incelemek için güçlü bir araç sunmakta ve yeni düzenleyici yolların keşfine zemin hazırlamaktadır.
Özet (Çeviri)
Objective: Mitochondria not only ensure the cellular energy production but also are key regulators of intermediary metabolism, calcium buffering, and apoptosis. These functions are mediated through continuous bidirectional communication with the nucleus. Such mitochondria–nucleus crosstalk is essential for maintaining cellular homeostasis and enabling adaptation to stress. The nucleus controls mitochondrial biogenesis and activity via anterograde signals, while mitochondria stimulate the nucleus via retrograde signals by sensing changes in energy levels, ROS production, or protein folding. Under conditions of mitochondrial damage or stress, mitophagy is activated not only as a quality control mechanism to eliminate dysfunctional mitochondria but also as a process that initiates bidirectional signaling to coordinate cellular adaptation. With the induction of the mitophagy process, mitochondria-derived signals are relayed to the nucleus, leading to reprogramming of stress-responsive gene expression and alterations in the nuclear protein landscape. In this study, we aimed to investigate mitochondria–nucleus crosstalk at the protein level. For this purpose, we aimed for a cellular model that enables controlled induction of mitochondrial stress and monitoring of the nuclear proteome using Split-TurboID–aided biotinylation. Methods: In this study, cells that contain a nucleus-targeted Split-TurboID proximity labeling system were used to enable traceable analysis of the nuclear proteome. Mitochondrial stress was induced in this cell line by transfecting a plasmid that enables controlled expression of the HOK protein. To select positive colonies, the immunofluorescence microscopy technique was used. Biotinylation was established by the addition of rapamycin to tetracycline-induced cells. Following protein isolation, biotinylated proteins were enriched using streptavidin-coated magnetic beads to obtain the nuclear proteome. The efficiency of biotinylation and enrichment was verified by Western Blot analysis. The enriched proteins were digested with trypsin into peptides and subsequently subjected to nLC–MS/MS analysis for protein identification. Results: After 8 hours of tetracycline induction, LC-MS/MS analysis identified 1152 proteins in the Hok(−) group and 1252 proteins in the Hok(+) group. Among the identified proteins, 726 were found to be localized in the nucleus in the Hok(−) group after 8 hours of tetracycline induction, whereas 861 nuclear-localized proteins were detected in the Hok(+) group. Accordingly, the 8-hour samples from the Hok(+) and Hok(−) groups were compared using LFQ. Evaluation of the data showed that in the Hok(+) group, 85 mitochondrial proteins were increased, whereas the expression of 80 mitochondrial proteins was decreased. Conclusion: Induction of Hok-GFP expression resulted in mitochondrial depolarization and disruption of mitochondrial network integrity, revealing a measurable cellular stress response. Comparative nuclear proteome analysis enabled by Split-TurboID–aided biotinylation allowed the identification of specific proteins involved in mitochondria nucleus crosstalk. This cellular model provides a robust platform for the real-time investigation of mitochondria–nucleus communication and facilitates the identification of novel regulatory pathways.
Benzer Tezler
- Değişken kalınlıklı eliptik levhaların burkulması ve titreşimleri
Stability and vibrations of elliptical plates with variable thickness
İSMAİL BAYER
Doktora
Türkçe
2002
Gemi Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiGemi İnşaatı Ana Bilim Dalı
PROF. DR. M. CENGİZ DÖKMECİ
- Ebelerin görev, yetki ve sorumluluklarını algılama durumlarının belirlenmesi ve geliştirilen ölçeğin geçerlik ve güvenirliğinin incelenmesi
Başlık çevirisi yok
EMİNE DAŞDİBİ BEYDİLLİ
- Yerinde uranyum ekstraksiyonu yöntemi üzerine deneysel ve teorik modelleme çalışmaları
Başlık çevirisi yok
HASANCAN OKUTAN
- Tetrasiklin kontrolü altında bakteriyal hok proteini ile indüklenen mitofajinin RFP-MİTO yardımı ile takibi
Monitoring of mitophagy induced by bacterial hok protein under tetracycline control by RFP-MITO
HUMEYRA ŞEYMA ÜNLÜ
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Tıbbi BiyolojiKocaeli ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT KASAP
- Kafes kirişlerinin sehim ve atalet momenti üzerine bir etüt
A study on the deformation and the inertia of the truss beams
MEHMET ZEKİ ÖZYURT