Geri Dön

DE NOVO FRATAXİN PROTEİNİ TASARIMI: KATLANMA MOTİFLERİ, METAL İYON BAĞLANMA BÖLGELERİ, MOLEKÜLER DOCKİNG VE MOLEKÜLER DİNAMİK SİMÜLASYONLAR İLE OPTİMAL STABİLİTE İÇİN YAPAY ZEKÂ DESTEKLİ YAKLAŞIMLAR

DE NOVO FRATAXIN PROTEIN DESIGN: AI-ASSISTED APPROACHES FOR OPTIMAL STABILITY THROUGH FOLDING MOTIFS, METAL ION BINDING SITES, MOLECULAR DOCKING AND MOLECULAR DYNAMICS SIMULATIONS

  1. Tez No: 1014173
  2. Yazar: KEVSER KÜBRA KIRBOĞA
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ECİR UĞUR KÜÇÜKSİLLE
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Süleyman Demirel Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Friedreich Ataksisi (FRDA), FXN genindeki GAA trinükleotid tekrar genişlemesiyle karakterize edilen otozomal resesif kalıtımlı nadir bir nörodejeneratif hastalıktır. Frataksin protein eksikliği, mitokondriyal demir birikimine, reaktif oksijen türlerinin artışına ve ilerleyici nöronal dejenerasyona yol açmaktadır. Hastalığın tedavisine yönelik mevcut terapötik yaklaşımların sınırlılıkları, frataksin proteininin yapısal stabilitesini ve fonksiyonel kapasitesini artırmaya odaklanan hesaplamalı protein mühendisliği stratejilerini zorunlu kılmaktadır. Bu tez çalışmasında, evrimsel analiz, difüzyon tabanlı de novo tasarım, pekiştirmeli öğrenme, allosterik ağ haritalama ve dijital sinyal işleme yaklaşımlarını bütünleşik bir çerçevede birleştiren çok katmanlı bir hesaplamalı mühendislik boru hattı geliştirilmiş ve elde edilen hesaplamalı öngörüler kapsamlı deneysel doğrulamalarla desteklenmiştir. Frataksin proteininin rasyonel yeniden tasarımına yönelik olarak ConSurf evrimsel korunurluk analizi gerçekleştirilmiş ve Döngü 1 bölgesi (pozisyon 115–123), orta düzey korunurluk skoru (4,8 ± 1,9) ile yüksek çözücü erişilebilirliğinin (>%60) kesiştiği optimal mühendislik hedefi olarak tanımlanmıştır. RFdiffusion v1.1.0 algoritması ile 200 geometrik olarak farklı protein omurga konformasyonu üretilmiş, ProteinMPNN v1.0.1 ile her omurgaya beş bağımsız sekans varyantı atanarak toplam 1000 aday dizilim elde edilmiştir. ProteinMPNN güven filtresi, AGGRESCAN agregasyon taraması ve FoldX termodinamik stabilite analizini kapsayan beş aşamalı hiyerarşik filtrasyon protokolü, başlangıç tasarım uzayını %99,6 oranında daraltarak dört öncü adayın belirlenmesini sağlamıştır. Bu adaylar arasında design_188 (EERVGGREI), 50 ns moleküler dinamik (MD) simülasyonlarında %24 omurga RMSD iyileşmesi, HADDOCK protein-protein yerleştirme simülasyonlarında %93 ISCU2 bağlanma korunumu ve SEC-MALS analizinde>%98 monomerik saflık ile en dengeli performans profilini sergilemiştir. K-ortalamalar kümeleme analizi, design_188'in yabanıl tipe kıyasla dramatik biçimde daraltılmış konformasyonel topluluğa sahip olduğunu ortaya koymuş (Küme 0 doluluk: %62,3'e karşı %39,8); NMR ¹⁵N omurga relaksasyon analizi (S² düzen parametreleri) ile MD simülasyonlarının deneysel esneklik profilleriyle kantitatif uyumu doğrulanmıştır (Pearson r = 0,675, p = 0,003). Döngü 1 yeniden tasarımının ötesinde, frataksin proteininin C-terminal bölgesinin kapsamlı yeniden modellenmesine yönelik olarak fizik bilgili pekiştirmeli öğrenme ile transformer mimarisini birleştiren özgün PhyRL-Former çerçevesi geliştirilmiştir. ESM-2 protein dil modeli (650M parametre) tabanlı mutant üretim motoru ile AlphaFold2 yapısal değerlendirmesini entegre eden bu iteratif optimizasyon sistemi, adaptif keşif-sömürü stratejisi aracılığıyla 12 iterasyon boyunca 1200 mutant varyantını değerlendirmiş ve kampanya genelinde en yüksek pLDDT skorunu 73,1'lik yabanıl tip temel değerinden 74,55'e yükselterek istatistiksel olarak anlamlı bir iyileşme elde etmiştir (p = 0,038, Cohen's d = 0,91). Bağımsız optimizasyon yörüngelerinde üretilen iki en iyi varyantın 35 özdeş substitüsyonu paylaşması (iter8_mut_161 için %92, iter11_mut_401 için %88 örtüşme), PhyRL-Former'ın işlevsel açıdan ilgili stabilize edici mutasyon kümesini güvenilir biçimde tanımladığının güçlü kanıtını oluşturmuştur. En yüksek pLDDT skoru iter8_mut_161'de elde edilmekle birlikte, yabanıl tip benzeri ISCU2 bağlanmasını koruması nedeniyle öncü terapötik aday olarak belirlenen iter11_mut_401, 500 ns tüm-atom MD simülasyonlarında %44,1 RMSD azalması (0,34→0,19 nm), %82,1 rezidü başına RMSF azalması, %30,7 dönme yarıçapı kompaktlaşması ve %90 PCA serbest enerji manzarası daralmasıyla doğrulanmış dramatik yapısal iyileşmeler sergilemiştir. Hesaplamalı öngörüler kapsamlı biyofiziksel karakterizasyonla desteklenmiştir: diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC), +11,2°C erime sıcaklığı artışını (Tm: 52,3→63,5°C) ve %61 kalorimetrik açılma entalpisi artışını (ΔHcal: 280→450 kJ/mol) doğrulamış; dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi, MD tarafından öngörülen α-heliks (%34 artış) ve β-tabaka (%23 artış) içerik değişimlerini bağımsız olarak teyit etmiştir. İzotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), iter11_mut_401'in yabanıl tip benzeri ISCU2 bağlanma afinitesini koruduğunu ortaya koymuş (Kd = 0,60 ± 0,10 μM'ye karşı yabanıl tip: 0,50 ± 0,08 μM, p = 0,456); bu bulgu, yapısal stabilite artışının biyolojik fonksiyon korunumuyla eş zamanlı olarak başarılabileceğini kanıtlamıştır. Fe²⁺ koordinasyon mekanizmasının aydınlatılmasına yönelik klasik moleküler dinamik, metadinamik, alkimyasal serbest enerji pertürbasyonu (FEP) ve kuantum mekaniksel küme hesaplamalarını birleştiren çok ölçekli bir yaklaşım uygulanmıştır. Bu analizler, Fe²⁺ iyonunun kanonik asidik sırt yerine C-terminal Pocket 2 bölgesinde (GLU184, LYS208) koordine olduğunu ve bu bölgenin asidik sırta göre ΔΔG = −16,85 kJ/mol ile termodinamik açıdan tercih edildiğini ortaya koyarak çift-bölge bağlanma modelini desteklemiştir. Frataksin proteininin dinamik düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasına yönelik olarak transfer entropi analizi uygulanmış ve allosterik iletişim ağı ilk kez sistematik biçimde haritalanmıştır. Üç bağımsız 500 ns replika simülasyonundan (toplam 1,5 μs örnekleme) elde edilen yönlendirilmiş bilgi akışı verileri, LEU47 ve LEU51'in, demiri koordine eden asidik sırt rezidülerinden (ASP122, ASP124, GLU189) yapısal olarak ayrı gömülü hidrofobik çekirdek pozisyonlarında (LEU136/LEU140 Cα'sından sırt rezidülerine 6,7–11,6 Å, Cα–Cα, PDB 1EKG) yer almasına karşın birincil allosterik sinyal kaynakları olarak işlev gördüğünü ortaya koymuştur. Kaynak (LEU47/51→aktarma istasyonu (LEU101/105)→alıcı (ASP33/35/GLU100) şeklinde tanımlanan hiyerarşik sinyal ağı topolojisi, çok teknikli ortogonal doğrulama stratejisiyle desteklenmiştir: NMR ¹⁵N relaksasyon ölçümleri hub rezidülerde yüksek R₂/R₁ oranları (LEU47: 9,90; LEU51: 10,00) ve mikrosaniye-milisaniye konformasyonel değişimi (kex ≈ 1720 s⁻¹) tanımlamış; HDX-MS koruma faktörleri Fe²⁺ bağlanması üzerine çift yönlü allosterik bağlanmayı doğrulamıştır (asidik sırtta Δln(PF) > +2,0; hub rezidülerde Δln(PF) < −0,8). Bölge yönlendirilmiş mutagenez çalışmaları, allosterik ağın fonksiyonel önemini kesin olarak kanıtlamıştır: L47A mutasyonu, demir bağlama afinitesinde 4,2 kat azalmaya (Kd = 102,5 ± 12,8 μM) ve termal stabilitede −11,2°C düşüşe yol açmış; mutant etki sıra düzeni (L47A> L51A> L105A> L101A) hesaplamalı etki skorlarıyla mükemmel korelasyon sergilemiş (Kd için R² = 0,96; ΔTm için R² = 0,85, p < 0,001), negatif kontrol mutantları ise anlamlı destabilizasyon göstermemiştir (|ΔTm| <1,5°C). MD yörüngelerinden biyolojik açıdan anlamlı konformasyonel dinamiklerin güvenilir biçimde çıkarılmasına yönelik olarak dijital sinyal işleme ve temel bileşen analizi (PCA) tabanlı boyut indirgemeden oluşan sistematik bir hesaplamalı çerçeve geliştirilmiştir. Savitzky-Golay filtrelemesi (pencere uzunluğu: 51 kare, polinom mertebesi: 3), frataksin RMSD yörüngesi için 23,15 dB sinyal-gürültü oranı sağlamış ve beş alternatif filtreleme tekniğinin (Wavelet, Gaussian, Butterworth, Hareketli Ortalama) hem frataksin hem de Karbonik Anhidraz IX (CAIX) validasyon sistemi üzerinde karşılaştırmalı değerlendirmesi tutarlı performans sıralaması ortaya koymuştur. PCA tabanlı boyut indirgeme ile 357 boyutlu konfigürasyon uzayı 30 temel bileşene indirgenmiş (11,9:1 sıkıştırma oranı, %80 kümülatif varyans); geliştirilen çerçevenin farklı dinamik özelliklere sahip protein sistemlerine genelleştirilebilirliği CAIX üzerinde doğrulanmıştır. Sonuç olarak bu tez, dört bağımsız çalışma kolunun birbiriyle tutarlı bulgular ürettiği bütüncül bir hesaplamalı protein mühendisliği yaklaşımı sunmaktadır. Evrimsel korunurluk güdümlü de novo Döngü 1 tasarımı, PhyRL-Former tabanlı C-terminal optimizasyonu, transfer entropi ile allosterik ağ haritalama ve dijital sinyal işleme çerçevesinin entegrasyonu, frataksin proteininin yapısal stabilitesini ISCU2 etkileşim kapasitesini koruyarak artırmayı başarmış ve FRDA için potansiyel protein replasman terapisi adayları ortaya koymuştur. Geliştirilen metodolojik çerçeve, farklı terapötik protein hedeflerine uygulanabilir genel bir hesaplamalı mühendislik boru hattı niteliği taşımaktadır.

Özet (Çeviri)

Friedreich Ataxia (FRDA) is a rare autosomal recessive neurodegenerative disorder characterized by GAA trinucleotide repeat expansion in the FXN gene. Frataxin protein deficiency leads to mitochondrial iron accumulation, elevated reactive oxygen species, and progressive neuronal degeneration. The limitations of current therapeutic approaches necessitate computational protein engineering strategies aimed at enhancing the structural stability and functional capacity of the frataxin protein. In this thesis, a multilayered computational engineering pipeline was developed that integrates evolutionary analysis, diffusion-based de novo design, reinforcement learning, allosteric network mapping, and digital signal processing within a unified framework, and the resulting computational predictions were substantiated through comprehensive experimental validations. Toward the rational redesign of the frataxin protein, ConSurf evolutionary conservation analysis was performed, identifying the Loop 1 region (positions 115–123) as the optimal engineering target at the intersection of moderate conservation score (4.8 ± 1.9) and high solvent accessibility (>60%). The RFdiffusion v1.1.0 algorithm generated 200 geometrically distinct protein backbone conformations, and ProteinMPNN v1.0.1 assigned five independent sequence variants per backbone, yielding a total of 1000 candidate sequences. A five-stage hierarchical filtration protocol encompassing ProteinMPNN confidence filtering, AGGRESCAN aggregation screening, and FoldX thermodynamic stability analysis narrowed the initial design space by 99.6%, enabling the identification of four lead candidates. Among these, design_188 (EERVGGREI) exhibited the most balanced performance profile, with 24% backbone RMSD improvement in 50 ns molecular dynamics (MD) simulations, 93% ISCU2 binding retention in HADDOCK protein–protein docking simulations, and >98% monomeric purity in SEC-MALS analysis. K-means clustering analysis revealed that design_188 possesses a dramatically narrowed conformational ensemble relative to the wild type (Cluster 0 occupancy: 62.3% vs. 39.8%), and NMR ¹⁵N backbone relaxation analysis (S² order parameters) confirmed the quantitative agreement between MD simulations and experimental flexibility profiles (Pearson r = 0.675, p = 0.003). Beyond Loop 1 redesign, the novel PhyRL-Former framework integrating physics-informed reinforcement learning with transformer architecture, was developed for comprehensive remodeling of the frataxin C-terminal region. This iterative optimization system, which combines an ESM-2 protein language model (650M parameters)-based mutant generation engine with AlphaFold2 structural evaluation, assessed 1200 mutant variants over 12 iterations through an adaptive exploration–exploitation strategy, achieving a statistically significant improvement, raising the best pLDDT score across the campaign from the wild-type baseline of 73.1 to 74.55 (p = 0.038, Cohen's d = 0.91). The sharing of 35 identical substitutions (92% overlap for iter8_mut_161, 88% for iter11_mut_401) between two top-performing variants produced from independent optimization trajectories constituted compelling evidence that PhyRL-Former reliably identifies functionally relevant stabilizing mutation sets. The leading therapeutic candidate, iter11_mut_401, demonstrated dramatic structural improvements validated by 500 ns all-atom MD simulations: 44.1% RMSD reduction (0.34→0.19 nm), 82.1% per-residue RMSF reduction, 30.7% radius of gyration compaction, and 90% PCA free energy landscape contraction. Computational predictions were corroborated by comprehensive biophysical characterization: differential scanning calorimetry (DSC) confirmed a +11.2°C melting temperature increase (Tm: 52.3→63.5°C) and 61% increase in calorimetric unfolding enthalpy (ΔHcal: 280→450 kJ/mol); circular dichroism (CD) spectroscopy independently verified the MD-predicted increases in α-helix (+34%) and β-sheet (+23%) content. Isothermal titration calorimetry (ITC) revealed that iter11_mut_401 preserves wild-type-like ISCU2 binding affinity (Kd = 0.60 ± 0.10 μM vs. wild-type: 0.50 ± 0.08 μM, p = 0.456), demonstrating that enhanced structural stability can be achieved concurrently with the preservation of biological function. To elucidate the Fe²⁺ coordination mechanism, a multiscale approach combining classical molecular dynamics, metadynamics, alchemical free energy perturbation (FEP), and quantum mechanical cluster calculations was applied. These analyses revealed that the Fe²⁺ ion is coordinated at the C-terminal Pocket 2 site (GLU184, LYS208) rather than the canonical acidic ridge, with this site being thermodynamically preferred over the acidic ridge by ΔΔG = −16.85 kJ/mol, thereby supporting a dual-site binding model. To elucidate the dynamic regulatory mechanisms of the frataxin protein, transfer entropy analysis was applied and the allosteric communication network was systematically mapped for the first time. Directed information flow data derived from three independent 500 ns replica simulations (total 1.5 μs sampling) revealed that LEU47 and LEU51 function as primary allosteric signal sources despite occupying buried hydrophobic-core positions structurally separated from the iron-coordinating acidic-ridge residues (LEU136/LEU140 Cα to ASP122, ASP124, and GLU189 = 6.7 to 11.6 Å, Cα–Cα, in PDB 1EKG). The hierarchical signal network topology defined as source (LEU47/51)→relay station (LEU101/105)→sink (ASP33/35/GLU100) was supported by a multi-technique orthogonal validation strategy: NMR ¹⁵N relaxation measurements identified elevated R₂/R₁ ratios at hub residues (LEU47: 9.90; LEU51: 10.00) and microsecond–millisecond conformational exchange (kex ≈ 1720 s⁻¹); HDX-MS protection factors confirmed bidirectional allosteric coupling upon Fe²⁺ binding (acidic ridge Δln(PF) > +2.0; hub residues Δln(PF) < −0.8). Site-directed mutagenesis studies definitively established the functional significance of the allosteric network: the L47A mutation caused a 4.2-fold decrease in iron binding affinity (Kd = 102.5 ± 12.8 μM) and a −11.2°C decrease in thermal stability; the mutant effect hierarchy (L47A> L51A> L105A> L101A) displayed excellent correlation with computational predictions (R² = 0.96 for Kd; R² = 0.85 for ΔTm; p < 0.001), while negative control mutants exhibited no significant destabilization (|ΔTm| < 1.5°C). A systematic computational framework comprising digital signal processing and principal component analysis (PCA)-based dimensionality reduction was developed for the reliable extraction of biologically meaningful conformational dynamics from MD trajectories. Savitzky-Golay filtering (window length: 51 frames, polynomial order: 3) achieved a signal-to-noise ratio of 23.15 dB for the frataxin RMSD trajectory, and comparative evaluation of five alternative filtering techniques (Wavelet, Gaussian, Butterworth, Moving Average) on both frataxin and the Carbonic Anhydrase IX (CAIX) validation system yielded consistent performance rankings. PCA-based dimensionality reduction compressed the 357-dimensional configuration space to 30 principal components (11.9:1 compression ratio, 80% cumulative variance), and the generalizability of the developed framework to protein systems with diverse dynamic properties was validated on the CAIX system. In conclusion, this thesis presents a holistic computational protein engineering approach in which four independent lines of investigation produced mutually consistent findings. The integration of evolution-guided de novo Loop 1 design, PhyRL-Former-based C-terminal optimization, transfer entropy-driven allosteric network mapping, and the digital signal processing framework successfully enhanced the structural stability of the frataxin protein while preserving ISCU2 interaction capacity, thereby yielding potential protein replacement therapy candidates for FRDA. The developed methodological framework constitutes a generalizable computational engineering pipeline applicable to diverse therapeutic protein targets.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    79527

    De novo akut myeloblastik lösemilide in vivo all-trans retinoik asitin myeloblastlarda bcl-2 ekspresyonu ve sitostatik ilaç duyarlılığına olan etkilerinin incelenmesi

    The Effects of in vivo alltrans retinoic acid administration on bcl-2 expression and rhodamine 123 uptake/efflux in patients with de novo acute myeloblastic leukemia.

    CELALETTİN ÜSTÜN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    1999

    HematolojiAnkara Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MERAL BEKSAÇ

  2. Tez No

    86449

    De novo yapısal kromozom anomalilerinin ve marker kromozomların kökenlerinin“multiprobe slide”tekniği ile araştırılması

    Identification of de novo structural chromosome abnormalities and marker chromosomes using“multiprobe slide”tecnique

    GÜVEN TOKSOY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1999

    Tıbbi Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEHER BAŞARAN

  3. Tez No

    118197

    De novo lezyonlarda stent öncesi ELCA uygulamasının etkinlik ve güvenirliliği

    Başlık çevirisi yok

    ZAFER ÖZDAĞ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2002

    KardiyolojiFırat Üniversitesi

    Kardiyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. ERDOĞAN İLKAY

  4. Tez No

    208477

    Çok amaçlı karar problemlerinde duyarlılık analizi ve bulanık mantık ilişkisi: de novo programlama uygulaması

    The relationship between sensitivity analysis and fuzzy logic in multiple objective decision problems: de novo programming application

    NURULLAH UMARUSMAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2007

    EkonometriDokuz Eylül Üniversitesi

    Ekonometri Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. KAAN YARALIOĞLU

  5. Tez No

    297789

    De novo peptide design strategies

    Peptid dizayn stratejileri

    EVRİM BESRAY ÜNAL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Mühendislik BilimleriKoç Üniversitesi

    Hesaplamalı Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ATTİLA GÜRSOY

    PROF. DR. BURAK ERMAN

Geri Dön