Kimyasal modifikasyonlarla penisilin asilaz enziminin stabilizasyonu
Stabilization of penicillin G acylase enzyme by chemical modifications
- Tez No: 126666
- Danışmanlar: PROF. DR. ALTAN ERASLAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2002
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimyagerlik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 161
Özet
KİMYASAL MODİFİKASYONLARLA PENİSİLİN ASİLAZ ENZİMİNİN STABİLİZASYONU ÖZET Günümüzde enzim teknolojisi deterjan, süt, farmasötik, meyva suyu, tekstil endüstrilerinde, biracılıkta, şarap ve diğer içkilerin üretiminde, fırıncılıkta ve ayrıca tıpta kimyasal ve klinik analizlerde de kullanılmaktadır. Enzimlerin teknolojik uygulamalarda kullanılabilmeleri için çalışma koşullarında uzun süre stabil olmaları gerekir. Operasyonel stabilitenin uzatılması süreçteki enzim yinelenmelerinin sayısını düşürecek ve böylece oldukça pahalı olan enzim preparasyonlarının işletmeye olan maliyeti azalacaktır. Bu ise enzimatik süreçlerin maliyetini de azaltmış olacaktır. Enzim inaktivasyonlan, sıcaklık, ortam pH'sı, denature edici maddeler, oksijen, proteazlann varlığı gibi birçok faktörün etkisi ile gerçekleşir. Bu nedenle enzimlerin inaktivasyonu karşısında kararlılığı endüstriyel uygulamalar için vazgeçilmez bir unsurdur. Enzimlerin stabilizasyonu için dört ana yönteme başvurulabilir. Bunlar: 1 Doğal olarak yüksek stabiliteye sahip enzimleri üreten mikroorganizmaların aranması, 2 Stabilizator maddelerin enzim ortamına ilave edilmesi, 3 Enzim moleküllerinin kimyasal modifikasyonu, 4 Enzim moleküllerinin immobilizasyonudur. Kimyasal olarak modifiye olmuş enzimler bir çok potansiyel avantajlar gösterir. Bunlar çoğunlukla daha yüksek katalitik etki gösterirler ve deterjan gibi likit formülasyonlarda daha stabil olabilirler. Proteinlerin kimyasal modifikasyonları üzerinde yapılan yayınların sayısı fazla değildir. Çözünür enzimlerin kimyasal modifikasyonla stabilizasyonu üç farklı gerçekleştirilebilir. 1 Proteinlerin tersiyer yapılarındaki anahtar fonksiyon gruplarının modifikasyonu ile stabilizasyon, 2 Bifonksiyonel maddeler ile moleküllerarası çapraz bağlanma ile stabilizasyon, 3 Polisakkaritler gibi polimerler ile proteinlerin çözünür konjugaüan vasıtasıyla stabilizasyonBu çalışmada Eschericia coli ATCC 11105 mutantından elde edilen penisilin G asilaz (PGA) enziminin yukarıda belirtilen üç farklı kimyasal modifikasyon yaklaşımıyla, sıcaklık, pH ve organik çözücü denatürasyonuna karşı stabilizasyonu incelenmiştir. Kullanılan protein modifiye edici maddeler farklı molekül ağırlığındaki PEG bileşikleri, glioksilik asit, ftalik anhidrit, benzoil klorür, süksinik anhidrit, asetik anhidrit ve karboksimetilselüloz (CMC 90 kDa)'dur. PGA süksinimidil süksinat ve siyanür klorür ile aktive olmuş mPEG (mol ağ. 5000 Da), N-N'-disüksinimidil karbonat ile aktive olmuş PEG (mol ağ. 1450 Da) ve mPEG (mol ağ. 2000 Da), p-nitrofenilkarbonat ile aktive olmuş mPEG (mol ağ. 5000 Da) ve PEG (mol ağ. 2000Da) tresilat ile aktive olmuş mPEG (mol ağ. 5000 Da) ile konjuge edilmiş ve elde edilen konjuge enzim preparatlanmn sıcaklık ve organik çözücü denatürasyonuna karşı stabilizayon göstermediği belirlenmiştir. PGA bir bifonksiyonel bis imidoester olan dimetiladipmidat (DMA) ile çapraz bağlanarak modifiye edilmiştir. Modifiye enzimin suyla karışabilen 8 değişik organik çözücü varlığında (metanol, etanol, dimetil sülfoksit, izopropanol, dimetilformamid, aseton, asetonitril ve 1,4-dioksan) denatürasyona karşı stabilizasyon göstermemiştir. PGA periodat oksidasyon yöntemiyle dialdehit türevlerine aktive edilen nötral polisakkarit olan 11.5 kDa mol ağırlıklı dekstran ile konjugasyona uğratılmıştır. Konjugasyona enzimin organik çözücü ortamında denatürasyonunu önleyemediği belirlenmiştir. PGA molekülü üzerindeki serbest amino grupları ile Schiff bazı oluşturarak enzimin karboksilasyonunu sağlayan glioksilik asit ile modifiye edilen enzimin termal stabilitesi incelenmiş ve modifikasyonun stabiliteye anlamlı katkısı olmadığı gösterilmiştir. PGA molekülü üzerindeki serbest amino gruplarını ftalik, asetil ve süksinik anhidrit ve de benzoil klorür ile açilleyerek moleküldeki negatif elektrik yüklü grupların sayısında artma yapacak şekilde enzimin modifikasyonları gerçeldeştirilmiştir. Bu modifikasyonlarla da enzimin stabilizasyonuna yönelik sonuçlar alınamamıştır. Suda çözünebilmeleri, biyouyumlu olmaları ve toksik olmamaları nedeniyle son yıllarda iyonik yapıdaki polisakkaritler enzim teknolojisinde uygulama alanı bulmaktadırlar. İyonik polisakkaritlerin konjuge olduğu enzim moleküllerinde çapraz bağ oluşumunun ve elektrostatik etkileşimlerin enzim stabilizasyonunda önemli etken olduğu bilinmekle birlikte bu tip polimerlerle enzim modifikasyonuna yönelik literatürde az sayıda çalışma vardır ve PGA modifikasyonuna ilişkin çalışma bulunmamaktadır. Doğal ve CMC ile konjuge olmuş enzimin değişik sıcaklık ve pH değerlerinde belirlenen inaktivasyon hız sabitleri (ki), hesaplanan yanlanma ömürleri (HL) ile stabilizasyon faktörü değerleri Tablo 1 ve Tablo 2'de verilmiştir.Tablo 1. CMC-PGA ve Doğal PGA'ın değişen sıcaklıklar için inaktivasyon hız sabitleri (k;), yanlanma ömürleri (tı/2) ve stabilizasyon faktörleri (SF). Tablo 2. CMC-PGA ve PGA'ın farklı pH değerleri için inaktivasyon hız sabitleri (ki), yanlanma ömürleri (HL) ve stabilizasyon faktörleri (SF). PGA'ın sıcaklık ve pH karşısındaki en yüksek stabilitesi, 55°C 3.2 kat ve pH 8'de 4 kat olarak elde edilmiştir. CMC'un çapraz bağlanması sonucu PGA enziminin pH ve sıcaklık profilleri ile koat değeri değişmemiştir. Km, Vm değerleri ise azalmıştır. Doğal ve CMC ile modifiye olmuş PGA'm inaktivasyonunun aktivasyon enerjisi (Eai) belirlenmiş ve diğer termodinamik parametreleri hesaplanmıştır. Konjuge olmuş PGA için inaktivasyonun aktivasyon serbest enerjisi (AGı) doğal PGA'a göre daha yüksek bulunmuştur. Diğer yandan konjuge olmuş PGA için entalpi (AHı) ve entropi değerleri ise doğal PGA'a göre daha düşük olarak elde edilmiştir. Bundan başka Pen G hidrolizinin termodinamik parametreleri doğal ve CMC konjuge PGA için hesaplanmıştır. Bunlar aktivasyon enerjisi (Ea), aktivasyon serbest enerjisi (AG#), aktivasyon entalpisi (AH*), aktivasyon entropisi (AS ), substrat bağlanması için tranzisyon hali serbest enerjisi (AGe-t*) ve Pen G bağlanma serbest enerjisi (AGE^)'dir. Konjugasyonun PGA'm AH*, AS#, AGe-s değerlerinin azalmasına neden olduğu belirlenmiştir. Buna karşılık AG# değeri etkilenmezken AGe-t# değerinde artışa neden olmuştur. Aynca farklı pH değerleri için inaktivasyonun aktivasyon serbest enerjisi (AG,) hesaplanmış ve CMC ile konjuge edilmiş PGA'm doğal PGA'a göre daha yüksek bulunmuştur. CMC ile konjugasyon PGA'm sıcaklık ve sıcaklık ve pH'ya karşı stabilizasyonuna ek olarak enzimin Pen G hidroliz reaksiyonu için katalitik performansında da iyileşme sağlamıştır, çünkü doğal PGA' dan daha yüksek kcat/Kn, oranı göstermiştir.
Özet (Çeviri)
STABILIZATION OF PENICILLIN G ACYLASE ENZYME BY CHEMICAL MODIFICATION SUMMARY Today enzyme technology is widely applied in such industries as detergent, dairy, pharmaceutics, distilling, brewing, fruit, wine, milling, baking and textile, and also in chemical and clinical analysis in medicine. Enzymes should be stable for long times under operational conditions in order to be suitable for technological applications. The lengthening of operational stability will reduce the number of enzyme replacements and thus decrease the cost of enzyme preparations, which can be rather expensive. The cost of enzymatic processes will also be reduced. The main reason for the decrease of operational stability is the inactivation of the enzyme. Enzyme inactivation can take place by the action of several factors such as temperature, medium pH, denaturing agents, oxygen and proteases. Therefore, the stabilization of enzymes against inactivation is generally indispensable for their industrial applications. Four major methods can be applied in order to stabilize soluble enzymes. These are: 1. Screening of micro organisms for enzymes with enhanced intrinsic stability. 2. Addition of stabilising agents. 3. Chemical modification of enzyme molecules. 4. Immobilization of enzyme molecules. Chemically modified soluble enzymes show a number of potential advantages. They often exhibit higher catalytic activity and they may be more stable in liquid formulations, such as detergents. The stabilization of soluble enzymes by chemical modifications can be carried out in three ways: 1) Stabilisation by the modification of key functional groups in the tertiary structure of proteins, 2) Stabilisation by intramolecular cross-linking with bifunctional reagents, 3) Stabilisation by soluble conjugates of proteins with polysaccharides. In this work Escherichia coli penicillin G acylase (PGA) against temperature, pH and organic solvent denaturation was studied by using the chemical modification approaches indicated above. The modifying agents used for this purpose were PEG compound in various molecular weights, glyoxilic acid, phthalic anhydride, benzoyl xvuchloride, acetic anhydride, succinic anhydride and carboxymethylcellulose (CMC 90 kDa). The conjugation of PGA were carried out by succinimidyl succinate and cyanuric chloride activated mPEG (MW 5000 Da), N-N'-disuccinirnidyl carbonate activated PEG (MW 2000 Da), p-nitrophenylcarbonate activated mPEG (MW 5000 Da) and PEG (MW 2000 Da), tresilate activated mPEG (MW 5000 Da). Conjugated enzyme preparations did not show any stabilization against temperature and organic solvent denaturation. PGA was modified by dimethyl adipmidate by chemical cross-linking which is a homobifunctional bisimidoester. Cross-linked enzyme did not show stabilization effect against denaturation in the presence of 8 different water miscible organic solvents (methanol, ethanol, dimethylsulphoxide, iso-propanol, dimethylformamide, aceton, acetonitrile and 1,4-dioxane). PGA was conjugated by a neutral polysaccharide dextran (11.5 kDa MW) after the activation of dextran to dialdehyde derivative by periodate oxidation method. This conjugation also did not make any contribution to the stabilization of enzyme against organic solvent denaturation. PGA was modified by glyoxylic acid which cause to the carboxylation of enzyme by forming the SchifFs base with the free amino groups on the protein molecule. However no improvement was observed on the thermostability of enzyme after modification. The modification of the free amino groups of PGA by acylating agents phythalic, acetic, succinic anhydrides and benzoylchloride was also studied. The introduction of negatively charged groups to PGA molecule by these modifications did not provide any improvement on the stability of enzyme. Water solubility, biocompatibility and non-toxicity have favored the use of ionic polysaccharides in enzyme technology in recent years. The stabilizing effect of ionic polysaccharides on enzyme molecules is well known by causing the cross links and strengthening the electrostatic interactions after conjugation. However very little report have appeared in literature related to the conjugation of enzymes by ionic polysaccharides, and no report is available about the modification of PGA. In this work the conjugation of PGA was carried out by an ionic polysaccharide carboxymethylcellulose (CMC) at 90 kDa MW. The inactivation kinetics of enzyme out high temperatures and extreme pH values after conjugation and the level of stabilization caused conjugation was estimated. The 46 % fraction of total enzyme activity and 65 % fraction of total protein in PGA solution was conjugated by CMC. The amount of CMC bound protein was 33 % of the initial CMC concentration. The irreversibl inactivations of conjugated enzyme out temperatures between 45- 60°C and at pH values between 4-9 were obeyed to the first order inactivation kinetics. XVTllThe inactivation rate constants (k; values) determined at different temperature and pH values and the half life (HL) and stabilization factors (SF) calculated at same values for native and CMC conjugated PGA were given in Table 1 and Table 2. Table 1. Inactivation rate costants (kj, min“1), half life times (ti/2, min) and stabilization factors (SF) values of the native and CMC-PGA at different temperatures. Table 2. Inactivation rate costants (kj, min”1), half life times (ti/2, min) and stabilization factors (SF) values of the native and CMC-PGA at different pH values. The highest stability of CMC conjugated PGA was as 3.2 fold protection at 55°C and 4 fold protection at pH 8.0. The pH and temperature profiles and the kc* value of conjugated enzyme did not changed, but Km and Vm values were decreased. The activation energy of the inactivation of conjugated PGA was estimated and the other thermodynamic parameters of enzyme were calculated. Activation free energy of inactivation (AGt) was higher and enthalpy (AHi) and entropy values of inactivation were lower for CMC conjugated enzyme than that of native PGA. The thermodynamic parameters of pen G hydrolysis by native and CMC conjugated PGA were also calculated. These are the activation free energy (AG#), activation enthalpy (AH*), activation entropy (AS*), transition free energy for substrate binding(AGE-T#) and Pen G binding free energy AG&s. Conjugation was caused to the decrease on the AH*, AS# and AGks values of PGA, AG value was found to be uneffected but AGe-t# value has been increased often conjugation In addition activation free energy of inactivation (AG,) was calculated at different pH values for native and conjugated PGA and it was found to be higher for conjugated enzyme. XIXCMC conjugation was also provided improvement on the catalytic performance of enzyme in addition to its stabilization temperature and pH, because kcat/Km ratio of conjugated enzyme is higher than that of native PGA. XX
Benzer Tezler
- Xanthoria Parietina likeninden parietin izolasyonu ve kimyasal modifikasyonları
Isolation and chemical modifications of parietin from Xanthoria Parietina lichen
VOLKAN MUSTAFA AKBULUT
- Yönlendirilmiş fiber yapıya sahip bakteriyel selüloz esaslı kompozitler kullanılarak çok fazlı osteokondral doku iskelesi üretimi
Production of multiphase osteochondral scaffold by using bacterial cellulose-based composites with oriented fiber structure
YUNUS EMRE ÖZ
Doktora
Türkçe
2023
BiyomühendislikEge ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ELİF ESİN HAMEŞ
DOÇ. DR. AYLİN ŞENDEMİR
- Multifonksiyonel heterohalkalı bileşiklerin sentezi
Synthesis of multifunctional heterocyclic compounds
FATMA ALBAYRAK HALAÇ
- Farklı yöntemlerle polimerize edilen bazı akrilik rezinlerin biolojik uyumlarının in vitro incelenmesi
Biocompatibility evaluation of some different polimerized denture base resins
GÜLFEM ERGÜN
Doktora
Türkçe
1998
Diş HekimliğiGazi ÜniversitesiProtetik Diş Tedavisi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EROL DEMİREL
- Asit ve bazlara karşı hassas yüzeyler için koruyucu hibrit kaplamaların geliştirilmesi
Fabrication of the inorganic-organic hybrid surface coatings for the protection of acid-base sensitive surfaces
CEYDA KIZILBOĞA
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
KimyaManisa Celal Bayar ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ AVNİ ASLAN