Geri Dön

Genetik mühendisliği ve metabolik yolizi mühendisliği teknikleriyle L-fenilalanin üretimi için biyoteknolojik proses geliştirilmesi

Bioprocess development for L-phenylalanine production by genetic engineering and metabolic pathway engineering techniques

  1. Tez No: 133250
  2. Yazar: İLKNUR ŞENVER ÖZÇELİK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. H. TUNÇER ÖZDAMAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: L-phenylalanine, medium design, metabolic engineering, intracellular reaction rates, genetic engineering, aroH, recombinant Bacillus, bioreactor operation conditions, oxygen trasfer
  7. Yıl: 2003
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ankara Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 274

Özet

ÖZET Doktora Tezi GENETİK MÜHENDİSLİĞİ VE METABOLİK YOLİZİ MÜHENDİSLİĞİ TEKNİKLERİYLE L-FENİLALANİN ÜRETİMİ İÇİN BİYOPROSES GELİŞTİRİLMESİ İlknur Şenver ÖZÇELÜC Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: ProtDr. H.Tunçer ÖZDAMAR Beş alt programdan oluşan doktora çalışmasının birinci evresinde, L-fenilalanin üretimi için biyoteknolojik proses geliştirilmesi amacıyla önce üretim potansiyeli olan mikroorganizma seçilmesi gerektiğinden, taranan mikroorganizmalar arasından, tanımlanmış bir ortamda en fazla L-fenilalanin üreten Bacillus subtilis NRRL-NRS 1315 (BS1315) seçilmiştir. Araştırmanın ikinci alt-programında, BS1315 üretim potansiyelini artırmak için ortam tasarımı yapılmış ve en uygun karbon kaynağı ve derişimi, azot kaynağı ve derişimi, N/C oram etkisi, katyonların etkisi ve derişimleri laboratuvar ölçek biyoreaktörlerde araştırılmıştır. L-fenilalanin yolizinin ilk girdileri olan fosfoenolprüvat (PEP) ve eritroz- 4-fosfat (E4P)'m ortama eklenmesi ile aromatik amino asit yolizine yapılan perturbatif etki araştırılmıştır. Metabolik yolizi analizi (MY A) doktora çalışmasının üçüncü alt-programını oluşturmuş; B.subtilis için 232 adet tepkimeden oluşan kompleks tepkime sistemi belirlenmiş, 184 bileşik için kütle korunum denklemlerinden oluşan matematik model kurulmuştur. E4P derişim etkisinin incelendiği deney verileri, ürün ve yan-ürün dağılımları kullanılarak denklem sisteminin çözülmesiyle hücreiçi tepkime hızları hesaplanmış; L-fenilalanin yolizinde darboğaz oluşturma potansiyeli olan tepkimeler bulunmuş ve L- fenilalanin yolizinde korizmat'tan prefenat'ın oluştuğu tepkimenin hızının en düşük olduğu yani birincil darboğazı bu tepkimenin oluşturduğu belirlenmiştir. Dördüncü alt-araştırma programında L-fenilalanin üretiminde verim ve seçimliliği artırmak için üç alt-programdan oluşan genetik mühendisliği (GM) araştırma programı ile L-fenilalanin biyotepkime yolizinde birincil darboğazı oluşturan hedef tepkimeyi katalizleyen korizmat mutaz enzimini kodlayan aroH geni önce pUC19 E.coli plasmidine klonlanmış, sonra da pMK4 B.coli-Bacillus shuttle plasmide sub-klonlama yapılmış ve rekombinant DNA pMK4::aroH farklı Bacillus türlerine aktarılarak rekombinant Bacillus subtilis türleri elde edilmiştir. Moleküler genetik tekniklerle geliştirilen rekombinant Bacillus türleri ve doğal Bacillus türleri ile karşılaştırmalı üretim yapılmış; en iyi L-fenilalanin üreticisi olan rekombinant ve doğal Bacillus türünün metabolik yolizlerindeki farklılıklar bulunmuş ve tartışılmıştır. Doktora programının beşinci alt- programında, ı-Bacillus subtilis ile L-fenilalanin üretimine pH, sıcaklık, N/C oram etkisi, başlangıç glukoz derişim etkileri incelenmiş v, bulunan en iyi tanımlanmış ortam bileşiminde ve koşullarda - laboratuvar ölçekli biyoreaktörlerde araştırılamayan biyoreaktör işletim parametresi- oksijen aktarım etkisi sistematik bir programla değişik karıştırma hızı ve hava giriş hızlarında araştırılmıştır. Tek karbon kaynağı 0e tanımlanmış üretim ortamında en uygun bileşimi (kgtn3): Glukoz, 10; (NKt^HPO,!, 5.657; KH2P04, 0.5; K2HP04, 0.5; MgS04.7H20, 0.1; MnSO,.H20, 0.1; CoCl2.6H20, 2*10's; ZnS04.7H20, 2*1 0'* kullanılarak; L-fenilalanin üretimi açısından biyoreaktör işletim koşulları pHo-6.8, T=37°C ve optimum oksijen aktarım koşullan Qo/Vr=0.3S wm, N=750 dk"1 olarak bulunmuştur. MYA analizi pilot ölçek biyoreaktör verileri kullanılarak tekrar yapılmış; laboratuvar ve pilot ölçek biyoreaktör sonuçlan kıyaslanmış, geliştirilen rekombinant mikroorganizma ve biyoreaktör işletim koşullarında verimdeki artış ve seçimlilikteki gelişim yorumlanmış, ve sonuçlar değerlendirilmiştir. 2003; 247 sayfa ANAHTAR KELİMELER : L-fenilalanin, ortam tasannu, metabolik mühendislik, hücreiçi tepkime hızlan, genetik mühendisliği, aroH, rekombinant Bacillus, biyoreaktör işletim koşulları, oksijen aktarımı

Özet (Çeviri)

ABSTRACT PİlD. Thesis BIOPROCESS DEVELOPMENT FOR L-PHENYLALANINE PRODUCTION BY GENETIC ENGINEERING AND METABOLIC PATHWAY ENGINEERING TECHNIQUES İlknur Şenver ÖZÇEIİK. Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor : ProfDr. Tunçer H. ÖZDAMAR Bacillus subtilis (NRRL-NRS 1315: BS1315) that is an industrially important microorganism was selected among many species in a defined medium as L-phenylalanine (Phe) producer. In order to increase the production potential of BS1315 a defined bioprocess medium based on glucose was designed and the optimum pH and temperature, and the effects of carbon and nitrogen sources and their concentrations together with the N/C ratio, the cations and their concentrations were determined in laboratory-scale batch bioreactors. Perturbation effects of the Phe synthesis pathway precursors PEP and E4P on the aromatic amino acid pathway were investigated. The mass flux balance based stoichiometric model for B.subtilis has been set up for metabolic flux analysis. The model considers 232 reaction fluxes, and 184 metabolites that are assumed to be in pseudo-steady state. The fluxes of the metabolic pathways through the central carbon pathways in the Phe fermentation process were calculated on the basis of the model using time profiles of glucose, dry cell, the product Phe, other amino acids, and organic acids. Metabolic flux analysis was conducted for the reference- and E4P perturbated- media. Results of the metabolic flux analysis revealed that induction by E4P influenced the pathway reactions via chorismate and prephanate towards Phe by increasing the flux values. Nevertheless, the reaction R96 catalysed by chorismate mutase has the lowest flux value among the preceding reactions of the pathway that reduces the proceeding reaction rates towards Phe. Thus, chorismate mutase (EC 5.4.99.5) is predicted to be the primary rate-limiting step among the Phe pathway reactions. In order to overcome the limitation of the reaction R96 and to increase the yield and selectivity in Phe production, within the genetic engineering research programme, aroK gene of BS1315 encoding chorismate mutase enzyme was cloned first onto the E.coli plasmid pUCI9, and then sub-cloned onto a multicopy Bacittus-E.coli shuttle vector pMK4 for developing recombinant B.subtilis carrying pMK4::oroH. pMK4.varoH was transfered into different B.subtilis hosts having different genotypypic features, and the Phe production performance of recombinant and wild-type microorganisms were compared. Intracellular reaction rates for the highest Phe producer t-B. subtilis A263 were calculated and the fluxes through the central carbon pathways were compared with the wild type results. While Phe production with r- B.subtilis A263 was increased ca. 2.5- fold, the flux of the reaction R96 was incerased ca. 4-fold. Thereafter, the effects of bioreactor operation conditions on Phe production in r-B.subtilis A263 were investigated using pilot-scale bioreactor systems. The influences of uncontrolled-pH and isothermal-temperature, glucose, and N concentrations together with the C/N ratio were investigated, and the optimum operation conditions were determined. Moreover, the effects of oxygen transfer at different Qo/V and N were investigated, and at pH"=6.8 and T=37°C, among the constant air-flow and agitation rate fermentations, the oxygen transfer «ration Q,/VR=0.35 wm, N=750 min ' produced maximum Phe. In order to generate a deep understanding, metabolic flux analysis for the optimum bioreactor operation contions was conducted, and the results were discussed on the basis of the intracellular reaction rates. 2003; 247 pages

Benzer Tezler

  1. Tez No

    76601

    Serin alkali proteaz enzimi üretimi için biyoproses geliştirilmesi

    Bioprocess development for serine alkaline protease production

    PINAR ÇALIK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1998

    Kimya MühendisliğiAnkara Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. H. TUNÇER ÖZDAMAR

  2. Tez No

    120140

    Serin alkali proteaz enziminin hücreiçi üretimini kontrol eden alanin ve serin grubu amino asitlerin enzim üretimine etkisi

    Effects of controlling alanine and serine group amino acids on serine alkaline protease production

    ARZU BAYRAM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2002

    Kimya MühendisliğiAnkara Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  3. Tez No

    213749

    Serin alkali proteaz sentezini kontrol eden aspartik asit grubu amino asitlerin proteaz üretimine etkisinin araştırılması

    Investigation of effects on protease production which aspartic acid group amino acid control of synthesis on serine alkaline protease

    BAHAR TOSUN ERCAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2007

    BiyomühendislikAnkara Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  4. Tez No

    223898

    Investigation of growth physiology and metabolism of mutant yeasts obtained by metabolic engineering

    Metabolizma mühendisliği kullanılarak elde edilen mutant mayaların büyüme fizyolojileri ve metabolizmalarının incelenmesi

    ONUR ERCAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2008

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  5. Tez No

    397999

    Molecular and physiological characterization of a salt-resistant Saccharomyces cerevisiae mutant obtained by evolutionary engineering

    Evrimsel mühendislik yöntemiyle elde edilmiş tuza dirençli bir Saccharomyces cerevisiae mutantının moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu

    ŞEYMA HANDE TEKARSLAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

    PROF. DR. CAROLA HUNTE

Geri Dön