Effect of homologous multiple copies of aspartokinase gene on cephamycin C biosynthesis in Streptomyces clavuligerus
Streptomyces clavuligerus'da apartokinaz geninin homolog çoklu kopyalarının sefamisin C üretimine etkisi
- Tez No: 167087
- Danışmanlar: PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ, DR. SEDEF TUNCA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Streptomyces clavuligerus, gen klonlaması, aspartokinaz, aspartat semialdehid dehidrojenaz, sefamisin C biyosentezi vıı, Streptomyces clavuligerus, gene cloning, aspartokinase, aspartate semialdehyde dehydrogenase, cephamycin C biosynthesis
- Yıl: 2005
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 99
Özet
Streptomyces clavuligerus gram-pozitif, fılamentöz bir bakteri olup, sefamisin C, klavulanik asit ve diğer klavamlar gibi ?-laktam bileşikleri (sekonder metabolitler) üretme yeteneğine sahip olmasıyla tanınmaktadır. Bu bileşiklerden sefamisin C, ikinci kuşak bir sefalosporin antibiyotiği olup büyük tıbbi öneme sahiptir, p- laktamların biyosentezi L-a-aminoadipik-asit (a-AAA), L-sistein ve L-valin'in ACV üçlü peptidini oluşturmak üzere ribozomal olmayan bağlanması ile başlar. S. clavuligerus' fa. a-aminoadipik asit (a-AAA), aspartat metabolik yolunun lizin- spesifik dalından gelen L-lizinin katabolik bir ürünü olup biyosentezi bu önemli metabolik yolun P-laktamları oluşturan karbon akışında anahtar bir sekonder denetleyicidir. Laboratuvarımızda daha önce yürütülen çalışmalarda S. clavuligerus 'un aspartik asit biyosentetik yolunun ilk iki enzimini kodlayan ask (aspartokinaz)-asd (aspartat visemialdehid dehidrojenaz) operonunun tamamı ilk kez klonlanmış, karakterize edilmiş ve heterolog gen ifadeleri elde edilmiştir. Şimdiki çalışmada, klonlanan ask- asd operonunun ya da sadece ask geninin çok kopyalı bir Streptomyces plazmid vektör üzerinde amplifikasyonu ve çoklu kopyalarının sefamisin C biyosentezine etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda üç ayrı strateji denenmiştir. Bunlardan pIJ702 vektörünü içeren ilk iki deneme rekombinant vektörün instabilitesi nedeniyle olumsuz sonuçlanmıştır. Üçüncü ve de sonuncu denemede, bir diğer Streptomyces vektörü olan pIJ486 aynı amaç için kullanılmış ve pIJ702'den çok daha stabil bir vektör olduğu bulunmuştur. Laboratuvarımızda paralel olarak yürütülen bir diğer çalışmada S. clavuligerus için oldukça etkin bir protoplast transformasyon protokolü geliştirilmiştir. pIJ486 vektörüne ask geni klonlandıktan sonra rekombinant vektör (pTB486) S. clavuligerus protoplastlanna bu protokol kullanılarak aktarılmıştır. Stabil rekombinant hücreler elde edildikten sonra bu genin çoklu kopyalarının sefamisin C biyosentezine etkileri araştırılmıştır. Ask genini ifade eden rekombinantların üreme hızlan ve miktarları önemli ölçüde düşmüştür. Bu sonuç, iki ayrı ve bağımsız ask-çdklu kopya rekombinantı ile yapılan denemelerle kanıtlanmıştır. Rekombinant 51 clavuligerus hücrelerinde (TB 3585 susu) Ask aktivitesi parental hücrelere kıyasla 5.5 kat artmış olmasına rağmen sefamisin C üretim miktarı sadece 1.1 kat artış göstermiştir.
Özet (Çeviri)
Streptomyces clavuligerus is a gram-positive filamentous bacterium well known for its ability to produce an array of P-lactam compounds (secondary metabolites) including cephamycin C, clavulanic acid and other structurally related clavams. Of these, cephamycin C is a second generation cephalosporin antibiotic having great medical significance. Biosynthesis of the p-lactam nucleus begins with the non- ribosomal condensation of L-a-aminoadipic acid (a- AAA), L-cysteine and L-valine to form the tripeptide a-aminoadipiyl-cysteinyl-valine (ACV). In Streptomyces clavuligerus, a-aminoadipic acid (a-AAA) is a catabolic product of L-lysine produced from the lysine branch of the aspartate pathway and its biosynthesis represents a key secondary metabolic regulatory step in carbon flow to P-lactam synthesis through this core pathway. ivThe ask (aspartokinase)-a.stf (aspartate semialdehyde dehydrogenase) gene cluster which encodes for the first key enzymes of aspartate pathway has already been cloned from S. clavuligerus, characterized and heterologously expressed for the first time in our laboratory. Amplification of ask-asd cluster or ask gene alone in a multi copy Streptomyces plasmid vector and determination of the effects of multiple copies on cephamycin C biosynthesis were the goals of the present study. For this purpose, three different strategies were employed. Of these, two strategies involving the use of vector pIJ702 did not work because of the instability of resulting recombinant plasmids. In the third and last strategy, we used another multicopy Streptomyces vector, pIJ486, which we showed in this study to be very stable for the same purpose. Meanwhile, an efficient protoplast transformation protocol was developed in our laboratory. Ask gene was cloned into this vector and S. clavuligerus protoplasts were efficiently transformed with the recombinant plasmid (pTB486) using the newly-developed protocol. After stable recombinants were obtained, the effects of the multiple copies of ask gene on cephamycin C biosynthesis were determined. There was a profound reduction in the rate and extent of growth of Ask overproducers, as experienced by testing two independent os^-multicopy recombinants. Although one such recombinant strain (designated S. clavuligerus TB 3585) had a 5.5 fold increased level of Ask activity as compared to the parental strain, it displayed only a 1.1 fold increase in specific production of cephamycin C.
Benzer Tezler
- Cloning, characterization and heterologons expression of the aspartokinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase genes from the cephamycin C producer streptomyces clavuligerus
Sefamisin C üreticisi streptomyces davuligerus'un aspartokinaz ve aspartat semialdehid dehidrojenaz genlerinin klonlanması, karakterizasyonu ve heterolog ekspresyonu
SEDEF TUNCA
Doktora
İngilizce
2002
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ
PROF. DR. JACQUELİNE PİRET
- Lon proteaz geninin çoklu kopyalarının streptomyces coelıcolor A3(2)'de homolog ifadesi ve Esherichia coli 'de heterolog ifadesi üzerine çalışmalar
Studies on expression of multiple copies of lon protease gene homologously in streptomyces coelicolor A3(2) and heterologously in Esherichia coli
HALİL YILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK
- Comparative whole genome sequencing and bioinformatic analysis of afreeze-thaw stress-resistant, industrial Saccharomyces cerevisiae strain
Donma-erime stresine dirençli bir endüstriyel Saccharomyces cerevisiae suşunun karşılaştırmalı tüm genom dizileme ve biyoinformatik analizi
BURCU TUĞBA ŞİMŞEK
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Pseudomonas aeruginosa'da PVDM proteininin yoksunluğunun virülansa etkisi
The effect of PVDM protein deprivation on virulence in Pseudomonas aeruginosa
ÇAĞRI SEDA KUL
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK
- Karaciğer iskemi reperfüzyonunda nötral sfingomyelinaz inhibisyonun endoplazmik retikulum stresine ve apoptotik hücre ölümüne olan etkisi
Neutral sphingomyelinase inhibition alleviates apoptosis, but not er stress, in liver ischemia-reperfusion injury
HAZAL TUZCU BALABAN
Doktora
Türkçe
2018
BiyokimyaAkdeniz ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUTAY AYDIN ASLAN