Geri Dön

Cloning, characterization and heterologons expression of the aspartokinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase genes from the cephamycin C producer streptomyces clavuligerus

Sefamisin C üreticisi streptomyces davuligerus'un aspartokinaz ve aspartat semialdehid dehidrojenaz genlerinin klonlanması, karakterizasyonu ve heterolog ekspresyonu

  1. Tez No: 119477
  2. Yazar: SEDEF TUNCA
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ, PROF. DR. JACQUELİNE PİRET
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Streptomyces clavuligerıts, Gen klonlamasi, Aspartokinaz, Aspartat semialdehid dehidrojenaz, Sefamisin C. V111, Streptomyces clavuligerus, Gene cloning, Aspartokinase, Aspartate semialdehyde dehydrogenase, Cephamycin C
  7. Yıl: 2002
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 149

Özet

oz SEFAMISIN C ÜRETİCİSİ STREPTOMYCES CLAVULIGERUS'UN ASPARTOKİNAZ VE ASPARTAT SEMİALDEHİD DEHİDROJENAZ GENLERİNİN KLONLANMASI, KARAKTERİZASYONU VE HETEROLOG EKSPRESYONU Tunca, Sedef Doktora, Biyoteknoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof.Dr. Gülay Özcengiz Yardımcı Tez Yöneticisi: Prof.Dr. Jacqueline Piret Ağustos 2002, 131 sayfa Aspartik asit ailesine bağlı amino asitlerin biyosentez yolunun lizine özgün dalındaki karbon akışı, Streptomyces clavuligerus tarafından üretilen vtgeniş spektrumlu bir B-laktam antibiyotiği olan sefamisin C'nin biyosentezinde hız sınırlayıcıdır. Bu çalışmada, Streptomyces clavuligerus NRRL 3585'in aspartik asit biyosentetik yolunun ilk iki reaksiyonunu katalizleyen enzimlerini kodlayan ask (aspartokinaz) ve asd (aspartat semialdehid dehidrojenaz) genleri ilk kez klonlanmış ve karakterize edilmiştir. Bu amaçla iki farklı E. coli vektörü üzerinde S. clavuligerus genomik DNA'sının dört mini kütüphanesi hazırlanmış ve rekombinant koloniler radyoaktif fosfat (P32) ile işaretlenmiş Nocardia lactamdurans' a ait ask-asd gen probları kullanılarak taranmıştır. Probla pozitif sinyal veren iki koloni bulunmuş ve bu pütatif klonlardan izole edilen rekombinant plazmidler E. coli CGSC 5074 (ask -), E. coli CGSC 5080 (asd ') and E. coli CGSC 5081 (asd ~) mutantlarına prototrof özelliklerini geri kazandırabilmişlerdir. Nükleotid dizi verisi ve kodon tercih analizi sonuçlan, üç eksiksiz open reading frame'in (ORFs) varlığına işaret etmiştir. ORF2, ORFl'in içinden başlayıp ORFl'le aynı stop kodonunu kullanarak sonuçlanmaktadır. ORF3 ve ORFl,2 birbirlerinden 2 nükleotid ile ayrıdırlar ve her biri sırayla 355 aa (M, 37 550), 421 aa (Mr 44 366) and 172 aa (Mr 18 129) olan proteinleri kodlamaktadırlar. Bu proteinlerin amino asit dizilerini veri tabanında mevcut diğer amino asit dizileriyle karşılaştırmak suretiyle, ORFl'in aspartokinazın büyük altünitesine, ORF2'nin aspartokinazın küçük altünitesine ve ORF3'ün de aspartat semialdehid dehidrogenaz enzimine karşılık geldikleri belirlenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, Streptomyces clavuligerus' un ask ve asd genlerinin, bu genleri genom üzerinde farklı bölgelerde içeren Streptomyces akiyoshiensis' dekinin tersine Mycobacterium, Bacillus, VII î*r*“,.' ”VNTASYON MSSJKSMCorynebacterium ve Amycolatopsis türlerinde olduğu gibi küme halinde organize olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, askafi geninin üst bölgesinde tespit edilen E. coli Ea70 promotorlarına benzeyen olası bir Streptomyces promotor bölgesinin yanısıra, asd geninin alt bölgesinde transkripsiyon terminatörü olarak görev yapabilecek, birbirini ters yönde tekrar eden bir nükleotid dizisi bulunmuştur. Klonlanan ask-asd gen kümesinin S. clavuligerus' da homolog gen ifadelerinin sağlanması ve bu genlerin çoklu kopyalarının sefamisin C üretimine etkilerinin belirlenmesi de bu çalışmanın amaçları arasında olduğundan, ask-asd gen kümesinin alt klonlanmasında kullanılmak üzere bir streptomyces plazmid vektörü (pNSTlOO) oluşturulmuştur. Bu vektöre ask-asd genleri takıldıkdan sonra rekombinant vektör kolaylıkla transforme edilebilen bir ara konakçı olan S. lividans'a. aktarılmıştır. Ancak klonlanmış DNA parçasının kaybedilmesi ve plasmid yapısının değişmesi sonucu stabil bir rekombinant elde edilebilmesi mümkün olmamıştır. Streptomycete konakçıda ortaya çıkan bu rekombinant plazmid instabilitesinin klonlanan genlerin iki ardışık promotor aracılığı ile aşırı miktarda ifade edilmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir.

Özet (Çeviri)

ABSTRACT CLONING, CHARACTERIZATION AND HETEROLOGOUS EXPRESSION OF THE ASPARTOKINASE AND ASPARTATE SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE GENES FROM THE CEPHAMYCIN C PRODUCER STREPTOMYCES CLAVULIGERUS Tunca, Sedef Ph.D., Department of Biotechnology Supervisor: Prof.Dr. Gülay Özcengiz Co-Supervisor: Prof.Dr. Jacqueline Piret August 2002, 131 pages The carbon flow through the lysine branch of aspartate pathway is a rate limiting step in the formation of cephamycin C, a broad spectrum P-lactam antibiotic produced by Streptomyces clavuligerus. In this study, the ask m(aspartokinase) and asd (aspartate semialdehyde dehydrogenase) genes which encode the enzymes catalyzing the first two steps of aspartate pathway were cloned and characterized as the first time from S. clavuligerus NRRL 3585. This was accomplished by constructing four mini-libraries of S. clavuligerus genomic DNA on two different E. coli vectors and screening recombinant colonies with radioactively labelled (P32) ask-asd genes of Nocardia lactamdurans. Two colonies giving positive signal with the probe were obtained and the recombinant plasmids from these putative clones could transform E. coli CGSC 5074 {ask -), E. coli CGSC 5080 {asd -) and E. coli CGSC 5081 {asd ~) to prototrophy. Nucleotide sequencing and codon preference analysis revealed three complete open reading frames (ORFs). ORF2 starts within ORF1 and terminates by using the same stop codon of ORF1. ORF3 and ORFl,2 are separated by 2 nucleotides and they were encoding proteins of 355 aa (Mr 37 550), 421 aa (Mr 44 366) and 172 aa (Mr 18 129), respectively. By comparing the amino acid sequences of these proteins to those available in the database, we identified ORF1 as the large (a) subunit of aspartokinase, ORF2 as the small (P) subunit of aspartokinase and ORF3 as the aspartate semialdehyde dehydrogenase. The results of present study showed that unlike Streptomyces akiyoshiensis in which ask and asd genes are well separated in genome, S. clavuligerus ask and asd genes are clustered in an operon as in Mycobacterium, Bacillus, Corynebacterium and Amycolatopsis species. Moreover, in addition to a putative Streptomyces promoter consensus region similar to E. co//-like Ea70 promoters in upstream region of the askafi, an IVinverted repeat sequence which probably serves as a transcriptional terminator was determined at the downstream of the asd gene. Homologous expression of ask-asd cluster in S. clavuligerus and determination of the effects of multiple copies of these genes on cephamycin C biosynthesis were also among the goals of the present research. A streptomyces plasmid vector suitable for subcloning of ask-asd cluster was constructed for this aim and designated pNSTlOO. The ask-asd genes were next ligated to this vector which was used to transform S. lividans as an intermediate transformable host. In spite of all our attempts to obtain stable recombinants, there occurred plasmid rearrangement and loss of insert in transformants. The recombinant plasmid instability in streptomycete host is thought to be due to overexpression of the cloned genes under two tandem promoters.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    485300

    Cloning and heterologous expression of a laccase isozyme gene from Coriolopsis polyzona MUCL 38443

    Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz izoenzimi kodlayan genin klonlanması ve ifade edilmesi

    ÖZNUR PEHLİVAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  2. Tez No

    315382

    Cloning of The Laccase cDNAs from Pycnoporus sanguineus MUCL 38531, Expression in Pichia pastoris and Characterization of Recombinant Laccases

    Pycnoporus sanguineus?tan Lakkaz cDNA?larının Klonlanması, Pichia pastoris?te Ekspresyonu ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu

    GÜNSELİ KURT GÜR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  3. Tez No

    600779

    Cloning, expression and characterization of the niger XYNB gene

    Başlık çevirisi yok

    KÜBRA BAYRAK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyoteknolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK

    DOÇ. DR. SEVNUR MANDACI

  4. Tez No

    863790

    Cloning two tomato pathogenesis-related-1 (SlPR-1) genes and generating vectors for their heterologous expression

    İki adet domates patojen ilişkili-1 (SlPR-1) genin klonlanması ve heterolog ifadelerinin belirlenmesi için farklı vektörlerin oluşturulması

    KÜBRA YILDIZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MEHMET AYDIN AKBUDAK

  5. Tez No

    762300

    Bacillus mojavensis TH309 suşundaki pektat liyaz (BmoPelC) enziminin klonlanması ve ifadesi üzerine çalışmalar

    Studies on cloning and expression of the pectate lyase (BmoPelC) enzyme from Bacillus mojavensis TH309

    NURAYAN AYDIN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK

Geri Dön