Geri Dön

Extracellular recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris

Pichia pastoris ile hücredışı insan büyüme hormonu üretimi

PDF İndir

  1. Tez No: 201695
  2. Yazar: MEHMET ALİ ORMAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Kimya Mühendisliği, Biotechnology, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: İnsan büyüme hormonu, Pichia Pastoris, AOX1, ortam tasarımı, oksijen aktarım, Human growth hormone, Pichia pastoris, AOX1, medium design, oxygen transfer
  7. Yıl: 2007
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 191

Özet

Bu çalışmada, biyoproses işletim parametrelerinin Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretimi üzerine etkisi sistematik olarak incelenmiştir. Bu kapsamda, rekombinant insan büyüme hormonunun (rhGH) hücre dışı salgılanması ve üretim ortamından saflaştırılması için metabolik mühendislik tasarımı yapılmıştır. İnsan büyüme hormonun kromatografik yöntemlerle ayrılmasını sağlayan 6xhistidin dizinini ve saflaştırılmış hormonun bu amino asitlerden ayrılmasını sağlayan Faktör Xa proteaz enziminin tanıdığı amino asit dizinini kodlayan DNA hGH hormonun genine PCR yöntemi ile entegre edilmiş; ve oluşturulan pPICZ?A::hGH, P. pastoris kromozomunun AOX1 (alkol oksidaz 1 enzim geni) bölgesine entegre edilerek, metanol tarafından tetiklenen AOX1 promoteri kontrolünde hGH sentezlenmiştir. Dot-blot analiz yöntemi ile klonlanmış olan mikroorganizmalar arasından en uygun farklı iki fenotip, Mut+ ve Muts, seçilmiştir. Mut+ ve Muts ile methanol derişiminin rhGH üretimine tanımlı ve kompleks ortamlarda etkisi incelenmiştir. Kompleks ortamda (BMMY ortam), hacimce %2(h/h) metanol derişiminde optimum rhGH saptanmıştır. Bu koşullarda, Mut+ fenotip 0.052 kg m-3, Muts ise 0.16 kg m-3 rhGH üretmiştir. Tanımlı ortamda, sadece metanol karbon kaynağı olarak kullanıldığında, Muts fenotipi metanolu tam olarak kullanamadığından yeterli hücre derişimine ulaşamamış ve rhGH üretimi gerçekleşmemiştir. Mut+ fenotipi metanolu etkin olarak kullanabildiğinden, hücre çoğalmış ve %3(h/h)'lük metanol derişimde 0.032 kg m?3 rhGH üretebilmiştir. Gliserol ve methanol birlikte kullanıldığında, bu iki fenotip için en çok rhGH üretimi farklı metanol derişimlerinde bulunmuştur. Optimum gliserol derişimde, 30 kg m-3, Muts %1(h/h) metanol içeren ortamda 0.110 kg m-3, Mut+ %4 (h/h) metanol içeren ortamda 0.060 kg m-3 rhGH üretebilmiştir. Tasarlanan üretim ortamı kullanılarak (%3 (h/h) metanol içeren tanımlı ortam) biyoreaktör işletim parametrelerinden oksijen aktarımı; fermantasyon ve oksijen aktarım karakteristikleri pilot ölçek biyoreaktörde incelenmiştir. İnsan büyüme hormunu üretiminde oksijen aktarımının etkileri, hava giriş hızı Q0/VR=0.5 vvm; karıştırma hızları N=250, 500, 625, 750 dk-1 ve koşullarında incelenmiştir. İnsan büyüme hormonunun, hücre, amino asit, organik asit konsantrasyonlarının kalma süresi ile değişimi; dinamik yöntem kullanılarak, biyoprosesin büyüme evresi süresince , oksijen tüketim hızı ve sıvı faz kütle aktarım katsayısı; verim ve yaşam katsayıları belirlenmiştir. İncelenen koşullar arasında en yüksek hGH derişimi 0.023 kg m-3 olarak 5.37 kg m-3 hücre konsantrasyonunda Q0/VR=0.5 vvm ve N=500 dk-1 koşullarında elde edilmiştir.

Özet (Çeviri)

In this study, the effects of bioprocess operation parameters on recombinant human growth hormone (rhGH) production by P. pastoris were systematically investigated. In this frame, first, for the extracellular expression and purification of human growth hormone by recombinant P. pastoris the cDNA of hGH, fused with a polyhistidine tag and also fused with a target site for the Factor Xa protease in which cleavage produces a mature N- and C- termini of rhGH, was cloned into pPICZ?A plasmid and the constructed system within the plasmid, pPICZ?A::hGH, was integrated to AOX1 locus of P. pastoris and expressed under alcohol oxidase promoter which is induced by methanol. With dot-blot analysis, the appropriate two strains producing human growth hormone at high levels and having different methanol utilization phenotype (Mut+ and Muts) were chosen among the other transformants. Then, the effects of methanol concentrations on the expression of rhGH and cell growth were analyzed and both of the phenotypes were compared in defined and complex media in laboratory scale air filtered shake bioreactors. The highest rhGH concentration for Mut+ and MutS, was found as 0.052 kg m-3 and 0.16 kg m-3, respectively, at 2 %(v/v) methanol concentration in complex medium. When methanol was used as the sole carbon source in defined medium, Muts phenotype had very low specific growth rate on methanol due to the intrinsic characteristics of it, therefore detectable rhGH was not observed, on the other hand, optimum rhGH concentration produced by Mut+ strain was found as 0.032 kg m-3 at 3% (v/v) methanol concentration in defined medium. In mixed system (glycerol/methanol) which is also defined, when the optimum glycerol concentration, 30 kg m-3, was used, Muts produced the highest rhGH, 0.110 kg m-3, at 1% (v/v) methanol concentration and any increase in methanol concentration resulted in lower rhGH production, on the other hand, Mut+ strain produced 0.060 kg m-3 rhGH at 4% (v/v) methanol concentration, which indicated that higher rhGH production capacity of Mut+ strain was obtained at high methanol concentrations. Using the designed defined medium for Mut+ phenotype where methanol was used as the sole carbon source with an optimum concentration of 3% (v/v), the effects of oxygen transfer on rhGH production, by-product formation, and cell growth, oxygen transfer and fermentation characteristics were investigated by using pilot scale bioreactor. Oxygen transfer effects on rhGH production were investigated at QO/VR=0.5 vvm; N=250, 500, 625, 750 min-1 conditions. The variations in rhGH , cell, amino acid and organic acid concentrations with the cell cultivation time, specific cell growth rate, the oxygen uptake rate, the liquid phase coefficient by using the dynamic method, maintenance coefficient for oxygen and yield coefficients were determined. The highest rhGH concentration was obtained at 0.5 vvm, 500 min-1 condition as 0.023 kg m-3 with 5.37 kg m-3 cell density.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    255235

    Effects of pH on human growth hormone production by Pichia pastoris considering the expression levels of regulatory genes

    Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretiminde düzenleyici genlerin ifade düzeylerini dikkate alarak pH etkisinin incelenmesi

    EDA BAYRAKTAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DR. REMZİYE YILMAZ

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

  2. Tez No

    255236

    Effects of carbon sources and feeding strategies on human growth hormone production by metabolically engineered Pichia pastoris

    Karbon kaynaklarının ve besleme stratejilerinin rekombinant Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretimine etkisi

    EDA AÇIK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER ÖZDAMAR

  3. Tez No

    463601

    Effect of signal sequences and promoters in recombinant extracellular protein production by Pichia pastoris

    Sinyal dizinlerin ve promotorların Pichia pastoris ile hücre-dışı rekombinant protein üretimine etkisi

    ASLAN MASSAHI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ D. SON

  4. Tez No

    570158

    Design and construction of double promoter systems andtheir use in pharmaceutical protein production inP. pastoris

    P. pastoris ikili-promotör sistemleri tasarımı ve oluşturulması ile farmasötik protein üretimine katkısı

    İREM DEMİR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

  5. Tez No

    233420

    Metabolik mühendislik ve reaksiyon mühendisliği prensipleriyle hücre-dışı rekombinant insan büyüme hormonu üretimi

    Extracellular recombinat human growth hormone production by metabolic engineering and reaction engineering principles

    ÖZGE DENİZ YILMAZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    Kimya MühendisliğiAnkara Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜZİDE ÇALIK

    PROF. DR. H. TUNÇER ÖZDAMAR

Geri Dön