Effects of carbon sources and feeding strategies on human growth hormone production by metabolically engineered Pichia pastoris
Karbon kaynaklarının ve besleme stratejilerinin rekombinant Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretimine etkisi
- Tez No: 255236
- Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. TUNÇER ÖZDAMAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2009
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 199
Özet
Bu çalışmada, değişik karbon kaynaklarının ve beslenme stratejilerinin Pichia pastoris ile rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) üretimine etkileri hücre çoğalması, rekombinant protein üretimi ve hGH ve alkol oksidaz (AOX) genlerinin ifade düzeyleri belirlenerek araştırılmıştır. Bu kapsamda, öncelikle, yüksek seviyede insan büyüme hormonu üretimi için kullanılacak suş Pichia pastoris-hGH'nin iki farklı metanol kullanım fenotipi, P. pastoris-hGH Mut+ ve P. pastoris-hGH MutS, arasından seçilmiştir. Bu seçim sırasında, iki suş da gliserol/metanol ya da sorbitol/metanol olmak üzere iki farklı karbon kaynağı içeren üretim ortamlarında karşılaştırılmış ve 30 g/L sorbitol ve %1 (h/h) metanol içeren ortamda P. pastoris-hGH Mut+'nın daha yüksek hGH gen ifade düzeyine, 9.84x109 copies/mg CDW, ve rhGH üretim seviyesine, 120 mg/L, sahip olduğu bulunmuştur.Sonraki aşamada, sorbitol, mannitol, fruktoz, laktoz, sükroz, sitrik asit, laktik asit ve asetik asidin karbon kaynağı olarak etkisi P. pastoris-hGH Mut+ kullanılarak laboratuvar ölçekli biyoreaktörlerde incelenmiştir. Bunlardan sorbitol ve sükroz seçilerek yarı-kesikli biyoreaktörde indükleme fazının başında, ?=0.03h-1'de yarı-kesikli metanol besleme programı ile birlikte kesikli olarak eklenmiştir. Sükrozun rhGH üretimini inhibe etmemesine karşın hücre çoğalmasını sorbitol kadar desteklemediği bulunmuştur. Daha sonra sorbitol/metanol karışık beslemesini geliştirmek için üç farklı besleme stratejisi uygulanmıştır. Bu stratejiler: i) t=0 st'te tek kesikli sorbitol eklemesi, ii) t=0 ve 9 st'te iki kesikli sorbitol eklemesi, iii) AOX'u tetiklemek amacıyla t=24 st'te ani metanol eklemesi olarak uygulanmıştır. Bu üç farklı besleme stratejisi sorbitolsüz ortamda yapılan üretim ile karşılaştırılmıştır. Bu farklı stratejiler için substrat tüketimi, hücre çoğalması, rekombinant protein üretimi ve hGH ve AOX genlerinin ifade düzeyleri incelenmiştir. En yüksek hücre derişimi olan 55 g/L'ye üçüncü strateji ile ulaşılırken en yüksek rekombinant protein derişimi (301 g/L) iki kez sorbitol eklenerek uygulanan ikinci strateji ile elde edilmiştir. Bu en yüksek üretim koşulunda toplam substrat üzerinden elde edilen en yüksek hücre ve ürün verimleri sırasıyla 0.17 g/g ve 1.71 mg/g olarak bulunmuştur. Ayrıca en yüksek hGH ve AOX ifade düzeylerine de bu strateji ile ulaşılmıştır.
Özet (Çeviri)
In this study, effects of different carbon sources and their feeding strategies on recombinant human growth hormone (rhGH) production by Pichia pastoris were investigated by means of cell growth, recombinant protein production and expression levels of hGH and alcohol oxidase (AOX) genes. In this content, firstly, the strain to be used for high level rhGH production was selected between the two phenotypes, i.e., P. pastoris hGH-Mut+ and P. pastoris hGH-MutS. In this selection both phenotypes were compared in two different media containing glycerol/methanol or sorbitol/methanol and P. pastoris-hGH-Mut+ strain grown on medium containing 30 g/L sorbitol with 1% (v/v) methanol was found to have the highest hGH expression level and rhGH production level, 9.84x109 copies/mg CDW and 120 mg/L, respectively.Thereafter, effects of sorbitol, mannitol, fructose, lactose, sucrose, citric acid, lactic acid and acetic acid were investigated by using P. pastoris hGH-Mut+ strain in laboratory scale bioreactors. Among them sorbitol and sucrose were selected to be compared for production in pilot scale bioreactors by adding them batch-wise at the beginning of induction phase with fed batch methanol feeding scheme at ?=0.03h-1. It was shown that sucrose does not support cell growth as sorbitol although it does not repress recombinant protein production. Then three different feeding strategies were applied to develop sorbitol/methanol mixed feeding i) single sorbitol addition at t=0, ii) besides at t=0, adding second batch-wise sorbitol at t=9 h, iii) giving pulse methanol at t=24 h to trigger AOX promoter. These three strategies were compared with a production without addition of co-substrate sorbitol. Substrate consumption, cell growth, recombinant protein production and expression levels of hGH and AOX were investigated for these different feeding strategies. The highest cell concentration was achieved in third strategy as 55 g/L where the highest extracellular rhGH production (301 mg/L) was achieved in the second strategy, with addition of two times of sorbitol. For this highest recombinant protein production case, overall cell and product yield on total substrate were found as 0.17 g/g and 1.71 mg/g, respectively. Moreover, the highest hGH and AOX expression levels were obtained in this strategy.
Benzer Tezler
- Glucose-based feeding strategy development in recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris for semi-batch bioreactor operation
Pichia pastoris ile rekombinant insan büyüme hormonu üretiminde yarı-kesikli biyoreaktör işletimi için glukoz temelli besleme stratejisi geliştirilmesi
ABDULLAH KESKİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Bölümü
PROF. DR. PINAR ÇALIK
PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR
- Effects of CO-carbon sources in recombinant human erythropoietin production by pichia pastoris
Pichia pastoris ile rekombinant insan eritropoietin uretiminde ikinci karbon kaynaklarının etkileri
ŞÜKRAN MELDA ESKİTOROS
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. PINAR ÇALIK
- Determination of optimal bioreactor operational strategy and unstructured macrokinetic model for recombinant human growth hormone production on ethanol by a novel Pichia pastoris pADH2-cAT8-L2 based system
Pichia pastoris ile pADH2-cAT8-L2 promotor altında rekombinant insan büyüme hormonu üretimi için etanol-temelli biyoreaktör işletim stratejisi geliştirilmesi ve modellenmesi
OMAR WEHBE AL MASRI WEHBE AL MASRI
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyomühendislikOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. PINAR ÇALIK
- Semi-defined medium based feeding strategy development for human growth hormone production by recombinant Bacillus subtilis
Rekombinant Bacillus subtilis ile insan büyüme hormonu üretimi için yarı-tanımlı ortam temelli besleme stratejisi geliştirilmesi
SİBEL ÖZTÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
BiyomühendislikOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. PINAR ÇALIK
PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR
- Investigation of grey water treatment performance in a vertical subsurface flow constructed wetland
Dikey akışlı bir yapay sulak alanda gri su arıtma performansının değerlendirilmesi
ÖMER FURKAN KILIÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Çevre Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MAHMUT EKREM KARPUZCU