Geri Dön

Recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris and determination of its interaction with peptide ligands

Pichia pastoris ile rekombinant insan büyüme hormonu üretimi ve peptit ligandlarla etkileşiminin incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 269418
  2. Yazar: BAHAR İNANKUR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. BURAK ERMAN, PROF. DR. PINAR ÇALIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2010
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Bölümü
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 227

Özet

Bu çalışmada, Pichia pastoris ile çeşitli üretim parametrelerinin rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) üretimine etkileri yüksek derişimde ürün üretimini sağlamak amacıyla araştırılmış ve insan büyüme hormonuna afinite ve spesifiklik gösteren peptit dizinlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, çalışmanın ilk bölümünde sıcaklığın ve üretim ortamına Tween-20/80 eklenmesinin rhGH üretimi ve hücre çoğalmasına etkileri araştırılmıştır. T=30 ve 32°C koşulları arasında bir fark görülmezken, 27 ve 25oC'de hücre çoğalmasının yavaşladığı ve dolayısıyla üretimin belirgin düzeyde azaldığı görülmüştür. Sorbitolün ikinci karbon kaynağı olarak kullanıldığı durumda ortama ek olarak Tween-20/80 eklenmesinin biyoprosesi etkilemedigi ve sorbitolün ortamda bulunmadığı durumlarda yalnızca Tween eklenmesinin, sorbitol eklenmesi ile ayni pozitif etkiyi yapmadığı gözlemlenmiştir.Bu çalışmanın sonrasında T=30°C'de ve Tween ilavesi yapılmadan, üç set laboratuvar ölçekli biyoreaktör deneyi yapılmıştır. İlk sette, metanol besleme hızının biyoproses karakteristiklerine etkisi ?=0.02, 0.03 ve 0.04st-1 spesifik hücre çoğalma hızlarında incelenmiştir. En yüksek hücre derişimine ?=0.04 st -1 koşulunda ulaşılırken, en yüksek ürün derişimi ?=0.03 st -1 koşulunda elde edilmiştir. İkinci olarak, ?=0.03 st -1 e bağlı olarak belirlenen methanol besleme profili kullanılarak, pH=5.5 koşulu denenmiştir. En yüksek hücre derişimine, 45 g L-1, ve maksimum rhGH derişimine, 0.25 g L-1, t=18 st'te ulaşılmıştır. Son olarak, kesikli olarak sorbitol eklenmesinin biyoprosese etkisi 50 g L-1 sorbitolun üretim fazının t=0, 14 ve 31 st' lerinde kesikli olarak eklenmesi ile araştırılmıştır. Ortama sorbitol eklenmesinin üretim süresini uzattığı, böylelikle hücrelerin durağan faza daha geç ulaştığı gösterilmiştir. Ancak, üretim süresi uzadıkça artmaya devam eden proteaz derişimi, proses sonunda tek sefer kesikli sorbitol eklendiği koşuldaki ile proses sonunda görülen proteaz miktarının iki katına çıkmış; proses sonunda elde edilen rhGH derişiminde azalma görülmüştür.hGH'ye afinite gösterebilecek peptit dizinlerinin seçiminde faj display yöntemi kullanılmıştır. Buna ek olarak, literatürde bulunan ve bilgisayar ortamında dizayn edilen peptitler de alternatif dizinler olarak kullanılmıştır. Peptitler ve hGH etkileşimi izotermal titrasyon kalorimetre ve yüzey plasmon rezonans cihazları ile incelenmiştir.

Özet (Çeviri)

In this study, the aim was to achieve high concentration of recombinant human growth hormone (rhGH) production by recombinant Pichia pastoris by investigating the effects of various operation parameters and to determine the suitable peptide ligand sequence that shows affinity and specificity to hGH. In this context, firstly the effect of temperature and Tween-20/80 addition on production and cell growth were investigated. While at T=30 and 32°C, there was no difference, at 27 and 25°C cell growth slowed down and production decreased significantly. The addition of Tween-20/80 in existence of co-substrate sorbitol did not affect the bioprocess while in absence of sorbitol Tween alone did not show the same positive effect on product formation and cell growth.Thereafter at T=30°C, without addition of Tween, three sets of pilot scale bioreactor experiments were performed. In the first set, the effect of methanol feeding rate on bioprocess characteristics were investigated at the specific growth rates of ?=0.02, 0.03 and 0.04 h-1. While the highest cell concentration was achieved at ?=0.04 h-1, the highest rhGH concentration was achieved at ?=0.03 h-1. Secondly, conducting methanol feeding at ?=0.03 h-1, pH=5.5 experiment was conducted. The highest cell concentration, 45 g L-1 and maximum rhGH concentration 0.25 g L-1 were achieved at t=18 h of the process. Finally, the effect of batch sorbitol feeding on bioprocess was observed by the addition of 50 g L-1 sorbitol at t=0, 14 and 31 h of the production phase. It was shown that sorbitol addition to the medium increased process duration; hence cells enter stationary phase after a longer production phase. However, the protease concentration continued increasing with respect to time and at the end of the process reached twice the concentration it was obtained with single sorbitol addition case decreasing the rhGH concentration.In selection of the peptide sequence that shows affinity towards hGH, phage display method was conducted. Additionally the sequences from literature and computational design were used as alternatives. The interaction between these peptides and hGH was investigated by isothermal titration calorimetry and surface plasmon resonance.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    608356

    Determination of optimal bioreactor operational strategy and unstructured macrokinetic model for recombinant human growth hormone production on ethanol by a novel Pichia pastoris pADH2-cAT8-L2 based system

    Pichia pastoris ile pADH2-cAT8-L2 promotor altında rekombinant insan büyüme hormonu üretimi için etanol-temelli biyoreaktör işletim stratejisi geliştirilmesi ve modellenmesi

    OMAR WEHBE AL MASRI WEHBE AL MASRI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

  2. Tez No

    463601

    Effect of signal sequences and promoters in recombinant extracellular protein production by Pichia pastoris

    Sinyal dizinlerin ve promotorların Pichia pastoris ile hücre-dışı rekombinant protein üretimine etkisi

    ASLAN MASSAHI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ D. SON

  3. Tez No

    201695

    Extracellular recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris

    Pichia pastoris ile hücredışı insan büyüme hormonu üretimi

    MEHMET ALİ ORMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2007

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  4. Tez No

    255236

    Effects of carbon sources and feeding strategies on human growth hormone production by metabolically engineered Pichia pastoris

    Karbon kaynaklarının ve besleme stratejilerinin rekombinant Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretimine etkisi

    EDA AÇIK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER ÖZDAMAR

  5. Tez No

    441947

    Enhanced recombinant human growth hormone production by synchronous populations of two different strains of Pichia pastoris under GAP promoter

    Pichia pastoris'in iki farklı suşunun senkronize popülasyonları ile GAP promotörü altında ınsan büyüme hormonu üretimi

    DAMLA HÜCCETOĞULLARI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. MEHMET İNAN

Geri Dön