Geri Dön

Hidrofobik etkileşim kromatografisi ile plazmid dna saflaştırılması

Plasmid dna purification by using hydrophobic interaction chromatography

  1. Tez No: 299473
  2. Yazar: RECEP ÜZEK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. SERAP ŞENEL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Genetik, Kimya, Biochemistry, Genetics, Chemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2011
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 85

Özet

Plazmid DNA (pDNA) izolasyon ve saflaştırılması için Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (HIC) tercih edilmiştir. Bu amaçla, nano-iğneler içeren poli(2-hidroksietilmetakrilat-matekriloilamidofenilalanin), poli(HEMA-MAPA) kriyojeller hazırlanmıştır. MAPA monomeri L-fenil alaninin metakriloil klorür ile reaksiyonu sonucunda sentezlenmiştir. Yapısı 1H NMR ve FTIR yöntemleri ile incelenmiştir. Kriyojel sentezinde klasik yöntem izlenmiş, nano-iğneler oluşturarak yüzey alanının artırılması için dondur-kurut (freeze-drying) basamağı eklenmiştir. Karşılaştırma amacıyla poli(HEMA) kriyojelleri de sentezlenmiştir. BET analizleriyle poli(HEMA) kriyojelinin yüzey alanı 21.35 m2/g ve poli(HEMA-MAPA) kriyojelinin ise 36.00 m2/g olarak belirlenmiştir. Hazırlanan poli(HEMA-MAPA) kriyojelinin yapısına giren MAPA miktarı 67.12 µmol/g polimer olarak elementel analiz sonuçlarıyla belirlenmiştir. Yapı içerisindeki MAPA monomerinin varlığı FTIR analizleri ile de ispatlanmıştır. Kriyojellerin içyapısı ve yüzey özellikleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir.Sulu çözeltiden pDNA izolasyonu için 5 mL hacimde (1.20 cm çapında) kolonlar kullanılarak sürekli sistemde adsorpsiyon kapasitesini etkileyen bazı parametreler araştırılmıştır. DNA derişimi UV-görünür spektrofotometrede 260 nm'de ölçülen absorbans değerleri ile hesaplanmıştır. 25oC'de, optimum pH 5.5'de DNA adsorpsiyon kapasitesi 13.98 mg DNA/g kriyojel'dir. Başlangıç derişiminin adsorpsiyon kapasitesine olan etkisi incelendiğinde maksimum adsorpsiyon kapasitesi poli(HEMA) için 8.28 mg/g ve poli(HEMA-MAPA) için ise 45.31 mg/g'dır. Adsorpsiyon kapasitesi iyonik şiddet artışı (maksimum kapasite Na2SO4 ile elde edilmiştir) ve sıcaklık artışı ile (40oC'de maksimum kapasite 15.69 mg/g'dır) artmıştır. Desorpsiyon ajanı asetat (pH 5.5) tamponudur. 1 saatlik uygulama süresi için desorpsiyon oranı %91.57`dir. İzlenen 15 çevrim için adsorpsiyon kapasitesindeki küçük değişmeler (13.65 mg/g'dan 12.50 mg/g'a) matrisin tekrar kullanılabilirliğinin göstergesidir.Adsorpsiyon verileri Langmuir modeline uymuştur. Adsorpsiyon kinetiği yalancı-ikinci derece modeline daha uygun bulunmuştur. Farklı sıcaklıklarda Langmuir modeli uygulanarak ?Ho, ?So ve ?Go değerleri hesaplanmıştır.Poli(HEMA-MAPA) kriyojelleri ile E.coli lizatından izole edilen pDNA'nın saflığının ve molekül ağırlığının belirlenmesi için agaroz jel elektroforez çalışmaları yapılmıştır. Kriyojel süper sarmal (SC) pDNA ile kuvvetli etkişime girmektedir ve elüsyondaki pDNA'nın SC formunun baskın olması bunun göstergesidir. İzole edilen pDNA'nın yaklaşık 7000 baz çifti'ne (bç) sahip olduğu bulunmuştur.Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) tekniğiyle poli(HEMA-MAPA) kriyojellerinin safsızlıklara göre pDNA'ya 237.5 kat daha fazla seçicilik sağladığı bulunmuştur.

Özet (Çeviri)

?Hydrophobic Interaction Chromatography? (HIC) technique was chosen for isolation and purification of pDNA. Poly(2-hydroxyethyl metacrylate-metacryloylamidophenylalanine), poly(HEMA-MAPA) cryogel containing nano needles was prepared for this purpose. Firstly, the MAPA monomer was synthesized by reaction of L-phenyl-alanine with methacryloyl chloride. The structure was examined by 1H NMR and FTIR methods. A conventional method was followed for cryogels synthesis, except introducing a freeze-drying step to create the nano needles to increase the surface area. Poly(HEMA) cryogels were also prepared for comparison. The surface area determined by BET analysis was 21.35 m2/g and 36.00 m2/g for poly(HEMA) and poly(HEMA-MAPA), respectively. The MAPA content of resulting cryogels was 67.12 µmol/g polymer, based on elementel analysis results. The inclusion of MAPA into the structure was also proven by FTIR spectra. The surface and internal structures of cryogels were identified by SEM micrographs.Several parameters effecting adsorption capacity were examined in continuous mode using columns of 5 mL (diameter: 1.20 cm) in volume to isolate pDNA from aqueous solutions. DNA concentration was determined by absorbance measurements at 260 nm by a UV-visible spectrophotometer. The DNA adsorption capacity was 13.98 mg pDNA/g cryogel at 25oC and for optimum pH of 5.5. The maximum DNA adsorption capacities, 8.28 mg/g for poly(HEMA) and 45.31 mg/g for poly(HEMA-MAPA) were obtained when the effect of initial DNA concentration was examined. The adsorption capacity increased with increasing ionic strength (the maximum capacity was obtained for Na2SO4), and increasing temperature (the maximum capacity was 15.69 mg/g at 40oC). The acetate buffer (pH 5.5) was used as the desorption agent. The desorption ratio was 91.57 % for 1 h treatment. The negligible decrease in adsorption capacity (from 13.65 mg/g to 12.50 mg/g) negligible decrease, proved the reusability of the matrix after 15 cycles applied.The adsorption data fitted to Langmuir model. The adsorption kinetics followed the pseudo-second order model. Using Langmuir model at severel temperatures, ?Ho, ?So and ?Go values were calculated and reported.The purity and molar mass of pDNA isolated from lysate of E.coli by poly(HEMA-MAPA) cryogel were examined by agarose gel electrophoresis studies. The cryogel was in a stronger interaction with SC pDNA, and the approximate base pair of pDNA purified was 7000. SC pDNA was still the dominant form following the elution.Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) technique proved that the poly(HEMA-MAPA) cryogel adsorbed pDNA with a 237.5 fold selectivity with respect to impurities.

Benzer Tezler

  1. Supermacroporous hydrophobic affinity sorbents for protein chromatography

    Protein kromatografi için süpermakrogözenekli hidrofobik afinite sorbentler

    FATMA YILMAZ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2008

    BiyokimyaHacettepe Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HANDAN YAVUZ

    PROF. DR. ADİL DENİZLİ

  2. Pektinaz enziminin hidrofobik etkileşim kromatografisi ile saflaştırılması

    Purification of pectinase enzyme by hydrophobic interaction chromatography

    TUNAHAN FERHAT HASDAĞLI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyokimyaBalıkesir Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. OKTAY ARSLAN

    DR. ADEM ERGÜN

  3. Beta-glukozidaz enziminin hidrofobik etkileşim kromatografisi ile Olea Europea meyvesinden saflaştırılması, karakterizasyonu ile bazı pestisit ve ağır metallere karşı afinitesinin araştırılması

    The purification and characterization of ß-glucosidase enzyme from Olea Europea with hydrophobic interaction chromatography and the investigation on affinities of some pesticides and heavy metals to the enzyme

    HATİBE KARA

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    BiyokimyaBalıkesir Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SELMA SİNAN

  4. İmmobilize zeytin βeta-glukozidazının oleuropein hidrolizinde kullanılması

    The using immobilized olive beta-glucosidase in the hydrolization of oleuropein

    MİHRAP YAŞAR KAYA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    BiyokimyaBalıkesir Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ELİF SAVAŞ

    PROF. DR. FERAY KÖÇKAR

  5. Katı substrat fermentasyonu (KSF) ile Trichoderma harzianum ve Trichoderma viride türü funguslarda ksilanaz üretimi, saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerin belirlenmesi

    Xylanase production, purification and identification of biochemical characteristics of Trichoderma harzianum and Trichoderma viride species fungi through solid state fermentation

    HÜSEYİN ALPER İRTEM

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    MikrobiyolojiBalıkesir Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE DİLEK AZAZ