Hek-293 kültür hücrelerinde beta2-adrenerjik reseptör ligandlarının cAMP ve ERK yanıtları bakımından hücre kontaktına bağlı koşullu fonksiyonel seçiciliği
Cell contact dependent functional selectiviy of beta2-adrenergic receptor ligands in terms of cAMP and ERK responses in hek-293 culture cells
- Tez No: 307937
- Danışmanlar: PROF. DR. ONGUN ONARAN
- Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
- Konular: Eczacılık ve Farmakoloji, Pharmacy and Pharmacology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 109
Özet
G proteinlerine kenetli reseptörler (GPKR'ler), hücre dışı sinyallerin hücre içine iletilmesini sağlayan hücre yüzeyi reseptörlerinin en büyük ailesidir. Terapötik amaçla kullanılmakta olan ilaçların % 50'den fazlasının hedefi olmaları ve yeni ilaç keşfi çalışmaları için hala birer potansiyel hedef olarak görülmeleri nedeniyle, bu reseptörlerle sinyal iletim mekanizmalarının incelenmesi güncelliğini korumaktadır. Bu alanda özellikle son on yıla ait bulgular, klasik bilgi birikimine farklı açıdan bakmayı zorunlu kılmış ve yeni kavramların doğuşuna zemin hazırlamıştır. GPKR'lerle sinyal iletimine dair bu yeni kavramlardan biri ?Ligandların Fonksiyonel Seçiciliği? kavramıdır. Bu kavram, genel bir ifadeyle ?ligandların aynı reseptörle uyarılan farklı sinyal yollarını farklı efikasilerle uyarabilme yeteneği? olarak tanımlanabilir.Bu çalışma kapsamında fonksiyonel seçicilik kavramı bir GPKR olan ß2-AR (Beta2-Adrenerjik Reseptör) üzerinden ele alınmıştır. Heterolog olarak ß2-AR eksprese eden HEK-293 kültür hücrelerinde ß2-AR ligandlarının cAMP ve ERK (extracellular signal regulated kinase) yanıtları bakımından fonksiyonel seçiciliği değerlendirilmiştir. Çalışma sonunda şu sonuçlar elde edilmiştir: 1) Çalışmada test edilen ligandların iki yanıtı uyarma efikasileri genel olarak korele olduğu halde, 4 agonist (prokaterol, simaterol, klenbuterol, terbutalin) cAMP yanıtını yüksek efikasi ile uyarmalarına rağmen ERK yanıtını uyaramamaktadır. 2) Bu ligandların fonksiyonel seçiciliği hücre kültürü koşullarına bağlıdır. Hücre-hücre kontaktı tedrici olarak azaltıldıkça cAMP'nin ERK'i aktive etme yeteneği kazanmasına bağlı olarak bu 4 ligandın fonksiyonel seçiciliği ortadan kalkmaktadır. 3) cAMP'nin ERK'i aktive edemediği koşullarda ERK'i aktive edebilen katekolik ß2-AR ligandları (izoproterenol, adrenalin, dobutamin) ile uyarılan ERK yanıtının pertussis toksine duyarlı olması bu yanıtın Gi/o aracılı olduğunu düşündürmektedir.Çalışmanın bundan sonraki aşamasında cAMP-ERK ve Gi/o-ERK sinyal yolları bileşenlerinin incelenmesi hedeflenmiştir. Literatür bilgisine göre bu yollara aracılık etme potansiyeli bulunan proteinler B-Raf, C-Raf, Ras ve Rap'dır. Bu çalışmada, bu proteinlerin ve ERK'in aktivasyonunu değerlendirebilmek için, intramoleküler FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) prensibi ile çalışan Prin-C-Raf, Prin-B-Raf, Raichu-Rap, Raichu-Ras ve Miu2-ERK konstraktlarının, uygun araçlar olup olmadıkları incelenmiştir.FRET iki florofor arasındaki enerji transferini tanımlayan bir terimdir. Bu mekanizmada bir donör florofor tarafından yayılması beklenen ışık daha yayılmadan akseptör florofor tarafından ?emilmekte? (yani resonant enerji transferi olmakta) ve akseptör florofor kendi emisyon spekturumunda ışıma yapmaktadır. İki florofor arasında FRET'in gerçekleşebilmesi için florofor çifti arasındaki uzaklığın enerji transferine olanak sağlayacak ölçüde küçük (
Özet (Çeviri)
G-protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of cell surface receptors that transmit extracellular signals to intracellular milieu. The fact that more than 50 % of current therapeutics target the GPCRs, and that these proteins have still been considered as potential targets for new drugs, keeps the interest still alive towards GPCR-mediated signalling. Recent findings about GPCR-mediated signalling in the last decade gave rise to the recognition of new phenomena that have never been considered in the classical view of receptor action. One such phenomena is the so called ?Functional selectivity of ligands?, which refers to the fact that the receptor ligands are able to activate multiple signalling pathways (coupled to the same receptor) differentially. In other words, ligands may possess differential efficacies towards divergent signalling pathways that start from the same receptor.In the present study, we investigated functional selectivity of ß2-AR ligands in terms of their ability to stimulate cAMP and ERK (extracellular signal regulated kinase) responses through ß2-AR, which has long been considered as a prototypical member of the GPCR family. We used HEK cells expressing ß2-AR heterologously as a model system. We made the following observations: 1) Although the efficacy of the tested ligands in stimulating cAMP and ERK responses were generally well correlated, four agonists, namely, terbutaline, clenbuterol, cimaterol and procaterol, were unable to stimulate ERK response despite their high efficacy in activating cAMP response. 2) Functional selectivity observed with the latter four ligands depended on the confluence state of the cell culture, and it gradually fade away as the confluence went down. Then, it turned out that the confluence of the cell culture (or cell-to-cell contact) actually determines the ability of cAMP to stimulate ERK phosphorylation: cAMP gained the ability to stimulate ERK response as the confluence of the culture decreased, which explains why the otherwise selective ligands lost their functional selectivities in non-confluent cells. 3) ERK responses to catecholamines (namely adrenalin, isoproterenol and dobutamine) that were able to activate ERK in conditions where cAMP could not, were sensitive to pertussis toxin treatment, suggesting the involvement of Gi/o in this response.In the next phase of the study, we investigated the components of cAMP-ERK and Gi/o-ERK signalling pathways. It has been reported that B-Raf, C-Raf, Ras and Rap should be the fundamental proteins that mediate the signals in the ERK activation pathway. Therefore, we ask whether or not the FRET probes that are supposed to monitor the activity state of these proteins in living cells could be used to investigate the cAMP-ERK or Gi/o-ERK pathway. We used the following intramolecular FRET constructs: Prin-C-Raf, Prin-B-Raf, Raichu-Rap, Raichu-Ras and Miu2-ERK. The constructs were expressed heterologously in HEK 293 cells.The term FRET refers to Flourescence Resonance Energy Transfer, a phenomenon where the light that should be emitted from a donor fluorophore is ?absorbed? before it is emmited, by an acceptor fluorophore, which then emits light having a wave length within the emission spectrum of the acceptor. In order for such an energy transfer to occure, the distance between the donnor and acceptor fluorophores should not be large (typically
Benzer Tezler
- Dianthus orientalisin pankreas kanserindeki invazyon ve metastaz etkilerinin in vitro olarak araştırılması
In vitro investigation of invasion and metastasis effects of Dianthus ori̇entalis i̇n pancreatic cancer
BURAK SEVİNÇ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2024
Genel CerrahiNecmettin Erbakan ÜniversitesiGenel Cerrahi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET AYKUT YILDIRIM
- Farklı kültür hücrelerinde agonist uyarımı ile oluşan kalsiyum salınımının ileri yöntemlerle incelenmesi
Investigation of agonist induced calcium release with advanced methods in different cell lines
FİGEN ÇİÇEK
- Memeli kültür hücrelerinde hücre içi kalsiyum sinyalinde görev alan elemanların entegre bir sistem olarak incelenmesi
Examination of cooperation of the elements taking part in intracellular calcium signaling as an integrated system in mammalian culture cells
EROL ÖZGÜR
- İnsan embriyonik böbrek hücrelerinde RIC-8b proteininin golgi organeli fonksiyonları üzerine etkisi
The effect of RİC-8B protein on golgi organelle functions in human embryonic kidney cells
MUSTAFA BARAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
Fizyolojiİstanbul Medeniyet ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. RAMAZAN KOZAN
YRD. DOÇ. DR. ÜMİT ŞENER
- Berrak hücreli renal hücreli karsinomada yağ asit metabolizması ilişkili AMPK ve miR-33a ifadelerinin klinikopatolojik parametrelerle ilişkisinin TCGA veri setinde ve hücre hatlarında moleküler düzeyde analizi
Molecular analysis of the relationship between fatty acid metabolism related AMPK and miR-33a expressions and clinicopathological parameters in clear cell renal carcinoma in the TCGA data set and cell lines
MUSTAFA ZAFER TEMİZ
Doktora
Türkçe
2024
Moleküler Tıpİstanbul Kültür ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZGE BERRAK RENCÜZOĞULLARI