Genetik füzyon yoluyla floresan işaretli rekombinant antikorların tanıya yönelik geliştirilmesi
Development of fluorescently labeled recombinant antibodies for diagnostic purposes
- Tez No: 311216
- Danışmanlar: DR. BERRİN ERDAĞ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Kocaeli Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 90
Özet
Amaç: Bu çalışmada floresan ELİSA veya hücre görüntüleme çalışmalarında kullanılması için genetik füzyon ile mCherry floresan protein işaretli anti-HBsAg fragmentlerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda anti-HBsAg rekombinant antikoru kodlayan gen bir floresan protein (mCherry) kodlayan geni içeren pQE-30 ekspresyon vektörüne klonlanmıştır.Yöntemler: Bu çalışmada daha önce faj gösterim teknolojisi ile geliştirilen anti-HBsAg scFV kullanıldı. İlk olarak bu anti-HBsAg scFv KpnI ve SalI restriksiyon enzim kesim bölgeleri içeren spesifik primerler kullanılarak PZR ile amplifiye edildi. Daha sonra PZR ürünleri ve pQE30 vektörü KpnI ve Sall restriksiyon endonukleazları ile kesildi. Kesim ürünleri T4 DNA ligaz enzimi ile birleştirildikten sonra E.coli JM109 hücrelerine kalsiyum klorür yöntemi ile transforme edildi. Pozitif koloniler koloni PZR ve sonrasında DNA dizi analizi yöntemi ile doğrulandı. Hücreler 1 mM IPTG ile indüklendi ve His-tag afinite kolon kromatografisi ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış proteinlere SDS PAGE ve Western Blotlama analizleri uygulandı.Sonuçlar: Anti-HBsAg scFv kodlayan gen PZR yöntemi ile amplifiye edilmiştir ve mCherry-pQE30 vektörüne klonlanmıştır. Moleküler klonlama koloni PZR ve DNA sekans analizi ile doğrulanmıştır. Genetik füzyon ürününün protein ekspresyonu SDS PAGE ve Western blot yöntemleri ile kontrol edilmiştir. Yaklaşık olarak beklenilen 55.4 kDa değerinde protein bandı elde edilmiştir.Tartışma: Yapılan çalışma sonucunda scFv /mCherry füzyon proteini başarılı şekilde eksprese edilmiştir. ELİSA sonuçlarına göre saflaştırılmış proteinler HBsAg'ye zayıf bağlanma göstermişlerdir. Floresan rekombinant antikor füzyon yapısı ELISA çalışmalarında düşük bağlanma göstermesinin nedeni füzyon yapının doğru katlanmamış olmasından kaynaklanma ihtimali bulunmaktadır. Bu nedenle ileriki çalışmalarda öncelikle farklı koşullarda ?refolding? çalışmalarının yapılması gerekmektedir.
Özet (Çeviri)
Aim: In this study we aimed to develop mCherry fluorescent protein labeled anti-HBsAg fragments by genetically fusion in order to use in fluorescent ELISA or in cell imaging studies. In this context an anti-HBsAg recombinant antibody (scFv) coding gene was cloned into a pQE30 expression vector containing the gene encoding a fluorescent protein (mCherry).Methods: In this study, an anti HBsAg scFv previously developed in the project `Development of recombinant antibody against Hepatit B surface antigen by Phage display technology? was used. The anti-HBsAg scFv was first amplified by PCR using specific primers comprising Kpn I and Sal I restriction enzyme sites. Then the amplified PCR product and the pQE30 vector was digested with KpnI and SalI restriction endonucleases. Digestion products were ligated with T4 DNA ligase then transferred into E.Coli strain JM109 by calcium chloride transformation. Positive clones were confirmed by coloni PCR then by DNA sequencing. The fusion protein was induced with 1mM IPTG and purified with HIS tag affinity columns. Purified proteins were analyzed with SDS PAGE and Western blot.Results: The scFv encoding gene was amplified by PCR and cloned into the mCherry-pQE30 vector. The cloning was confirmed by DNA sequence analysis. The protein expression of the genetic fusion product was controlled with SDS PAGE and werstern blot and protein band of approximately 55.4 kDa was detected as expected.Conclusion: In this study a genetically fused scFv/mCherry fusion protein was successfully expressed. The results of ELISA show a low binding of the fluorescent recombinant antibody. This could because of the misfolding of the fusion protein. In order to overcome to this problem different refolding conditions must be tried.
Benzer Tezler
- Molecular relationship between bacilysin and surfactin biosynthesis in Bacillus subtilis
Bacillus subtilisde basilisin ve sürfaktin biyosentezi arasındaki moleküler ilişki
DİLAN ERGÜN
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Inhibition of HBsAg with stable transfection of Anti-HBsAg recombinant antibody in PLC/PRF/5 cell line
Anti-HBsAg rekombinant antikorunun stabil transfeksiyonu ile PLC/PRF/5 hücre hattinda HBsAg'nin inhibisyonu
ELİF AKTAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
GenetikGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TAMER YAĞCI
DR. AYLİN ÖZDEMİR BAHADIR
- Mobil telefon kullanımına bağlı oluşan 900-1800 mhz radyo frekans dalgalarının meydana getirdiği elektromanyetik alanın iliak kanat kemik mineral yoğunluğuna etkisi
The effect of electromagnetic fields on bone mineral density of iliac bone produced by 900-1800 mhz radio frequency waves dependent on cellular phone usage
BEŞİR ANDAÇ AKSOY
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2006
Ortopedi ve TravmatolojiSüleyman Demirel ÜniversitesiOrtopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. NEVRES HÜRRİYET AYDOĞAN
- Genetik kodlanmış floresans biyosensörlerin tasarımı ve optimizasyonu
Design and optimization of genetically encoded fluorescent biosensors
GÖZDE ÜLKER
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyokimyaEge ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SERAP EVRAN
DR. ÖĞR. ÜYESİ CANAN ÖZYURT
- Protein mühendisliği yoluyla ligand bağlayıcı protein ve fotoprotein temelli genetik kodlanmış sensörlerin tasarlanması
Designing of ligand binding protein and photoprotein based genetically encoded sensors via protein engineering
CANAN ÖZYURT
Doktora
Türkçe
2014
BiyokimyaEge ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AZMİ TELEFONCU
DOÇ. DR. SERAP EVRAN