Cloning of The Laccase cDNAs from Pycnoporus sanguineus MUCL 38531, Expression in Pichia pastoris and Characterization of Recombinant Laccases
Pycnoporus sanguineus?tan Lakkaz cDNA?larının Klonlanması, Pichia pastoris?te Ekspresyonu ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu
- Tez No: 315382
- Danışmanlar: DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2010
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 212
Özet
Lakkazlar aromatik bileşiklerin oksidasyonunu, oksijenin suya indirgenmesiyle katalizleyen çoklu bakır oksidazlardır. Çeşitli substratları okside edebilme özellikleri ile lakkazlar farklı biyoteknolojik uygulamalarda rol oynayan enzimler olarak son yıllarda ön plana çıkmaktadır. Lakkazların kağıt ve tekstil endüstrilerinden gelen atıksuların detoksifikasyonu, herbisitlerin ve pestisitlerin temizlenmesi, şarap, meyve suyu ve bira gibi içeceklerin işlenmesi, şeker pancarı pektininden jel oluşturulması, fırıncılıkta kullanılabilme özelliklerinin yanısıra kozmetik malzemesi ve biosensör yapımında da kullanılabildiği bildirilmektedir.Bu çalışmada beyaz çürükçül küf mantarı Pycnoporus sanguineus MUCL 38531'te lakkaz kodlayıcı lcc1 ve lcc2 genlerinin izolasyonu ve bu genlerin heterolog ekspresyonları ile karakterizasyonu amaçlanmıştır. Öncelikle Pycnoporus sanguineus genomunun taranması sonucunda iki farklı lakkaz kodlayıcı genin varlığı belirlenmiş ve bu genler lcc1 ve lcc2 olarak adlandırılmıştır. Tam boyda lcc1 ve lcc2 genleri izole edilmiş ve lcc1 cDNA'sının 1557 bç uzunluğunda olup, teorik olarak 20 amino asitlik sekresyon sinyali taşıyan 518 amino asitlik bir polipeptiti kodlayabildiği görülmüştür. lcc1 ve lcc2 genlerinin 10 intron içerdiği belirlenmiş olup, lcc2 geninin 2296 bç uzunluğunda ve 570 aminoasit kodlayan 1713 bçlik bir açık okuma çerçevesi içerdiği tespit edilmiştir.Lakkaz genlerinin klonlanmasının ardından heterolog ekspresyon yoluyla üretilebilmeleri sayesinde istenilen özellikleri taşıyan proteinlerin endüstriyel uygulamalarda kullanılabilecek düzeyde elde edilebilmesi mükün olabilmektedir. İzole edilen tam boyda lakkaz cDNA'ları maya mekik ekspresyon vektörü pPICZB'ye kendi sekresyon sinyal dizileri ile klonlanmış ve metilotrofik maya Pichia pastoris'te eksprese edilmiştir. Besiyeri, metanol ve bakır konsantrasyonlarının ekspresyon düzeyi üzerindeki etkisi belirlendikten sonra lakkazlar amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değiştirme ve jel filtrasyon kromatografisi teknikleriyle saflaştırılmıştır. Saflaştırılan proteinlerin ağırlıkları R-LCC1 ve R-LCC2 için sırasıyla 56 kDa ve 62 kDa olarak bulunmuş ve bu enzimler 600 nm'de lakkazlara özgü absorbansı vermedikleri için sarı lakkazlar olarak tanımlanmıştır. Aktivite üzerinde substrat etkisi incelendiğinde maksimum aktivitenin ABTS için izlendiği ve bu substrat kullanıldığında optimum pH 3.0 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklıklar R-LCC1 ve R-LCC2 için sırasıyla 60ºC ve 30ºC olarak belirlenmiş olup, LCC1'in termal stabilitesinin 30ºC'de daha iyi olduğu ve yarılanma ömrünün de 7 saatten fazla olduğu saptanmıştır. Saflaştırılan enzimler üzerinde sodyum azid, L-sistein ve SDS'nin inhibe edici etkisi olduğu görülmüş olup, enzimlerin katalitik özellikleri de hem ABTS hem de DMP substratları kullanılarak tespit edilmiştir.Sonuç olarak, bu tez çalışması ile beyaz küf mantarı Pycnoporus sanguienus MUCL 38531'tan iki adet lakkaz geninin izole edilmesi, P. pastoris mayasında heterolog ekspresyonu, saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu çalışmaları başarıyla gerçekleştirilmiştir. Ayrıca bu çalışma sayesinde kurulan ekspresyon sistemi aracılığıyla bazı tekstil boyalarının ve turuncu renkli antibiyotik pigment ?cinnabarin? biyosentezi başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma sonucunda lakkaz yapı-fonksiyonunun araştırılması ve protein mühendisliği çalışmalarında kullanılabilme potansiyeli olan yeni bir lakkaz üreticisi P. pastoris suşu elde edilmiştir.
Özet (Çeviri)
Laccases are blue multi copper oxidases catalyzing the reduction of oxygen to water coupled with oxidation of aromatic compounds. Laccases are currently accepted as highly interesting industrial enzymes because of their useful applications for several biotechnological processes such as the detoxification of the industrial effluents from the paper, pulp and textile industries, the bioremediation of the herbicides and pesticides, the processing of the beverages (wine, fruit juice and beer), the determination of the ascorbic acid, the gelation of the sugar beet pectin, baking, being as ingredients in cosmetics and as biosensor.The present research aimed at identification, heterologous expression and biochemical characterization of two novel laccases, lcc1 and lcc2, from white rot fungus Pycnoporus sanguineus MUCL 38531. Principally, the laccase specific genes within the genome of the white-rot fungi Pycnoporus sanguineus were screened and this study revealed two different laccase genes, designated as lcc1 and lcc2. Full-length lcc1 and lcc2 genes were isolated and the corresponding open reading frame for full length lcc1 cDNA is 1557 bp coding for 518 amino acids with a putative 20-residue signal sequence. lcc2 gene is 2296 bp in length, contains an open reading frame of 1713 bp and codes for 570 amino acids with a signal sequence of 27-residues. The genomic DNA sequence of both lcc1 and lcc2 genes revealed the 10 introns.The full-length lcc1 and lcc2 cDNAs were successfully cloned into the yeast shuttle expression vector pPICZB with their own secretion signal sequence and expressed in methylotrophic yeast Pichia pastoris. Factors influencing the expression such as nutrients, methanol and copper concentrations were,then, investigated. Recombinant laccases were purified to electrophoretically homogenous state by ammonium sulphate precipitation, Q-sepharose anion exchange and Sephadex G-100 size exclusion chromatography. The molecular weight of purified laccases have been estimated about 56 kDa and 62 kDa for R-LCC1 and R-LCC2 respectively and both laccases were categorized as a yellow laccase due to the lack of typical absorbance at 600 nm. Among tested compounds for substrate specificity, the maximum activity was observed for ABTS with pH optima 3.0. Although optimum temperatures were found as 60ºC and 30ºC, the thermostability was better at 30ºC with a half-life of more than 7 hours for LCC1. Sodium azide, L-cysteine and SDS were found as usual inhibitors for the purifed enzyme. The catalytic properties of the recombinant enzymes were also determined for both ABTS and DMP substrates.As a result, this work allowed obtaining the isolation of laccase genes from Pycnoporus sanguienus MUCL 38531, heterologous expression of two laccases in yeast P. pastoris, their purification and characterisation. Moreover, this research work revealed the potentiality of the developed expression system in industrial biosynthesis of textile dyes and antibiotic cinnabarin pigment. Promising performances of constructed novel laccase host, P. pastoris, will lead to further investigations on structure-function relationships and also protein engineering studies.
Benzer Tezler
- Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris
Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi
ORKUN PİNAR
Doktora
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Cloning and heterologous expression of a laccase isozyme gene from Coriolopsis polyzona MUCL 38443
Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz izoenzimi kodlayan genin klonlanması ve ifade edilmesi
ÖZNUR PEHLİVAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Lakkazın kızılçam kraft ve atık kağıt hamuru üzerindeki etkilerinin araştırılması
Studyi̇ng the effects of laccase on red pine kraft and waste paper pulp
MİRAY ŞAHİNKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyolojiKaradeniz Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
- Lakkaz enziminin b. licheniformis o12 bakterisinden saflaştırılması, bakteri dna'sından rekombinant üretimi, karakterizasyonu, biyoteknolojik uygulamaları
Purification of laccase enzyme from b. licheniformis o12 bacteria, recombinant production from bacteria dna, characterization, biotechnological applications
ARZU ÖZTÜRK KESEBİR
- Bacillus subtilisten lakkaz enzim izolasyonu, üretici genin klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve boya gideriminde etkinliğinin araştırılması
Izolation, cloning, characterization, and investigation of dye decolorization activity of laccase enzyme from Bacillus subtilis
ORKIDEH HAJIPOUR
Doktora
Türkçe
2020
BiyoteknolojiPamukkale ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NAZİME MERCAN DOĞAN
PROF. DR. SADIK DİNÇER