Bacillus subtilisten lakkaz enzim izolasyonu, üretici genin klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve boya gideriminde etkinliğinin araştırılması
Izolation, cloning, characterization, and investigation of dye decolorization activity of laccase enzyme from Bacillus subtilis
- Tez No: 638625
- Danışmanlar: PROF. DR. NAZİME MERCAN DOĞAN, PROF. DR. SADIK DİNÇER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Pamukkale Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 100
Özet
Bakteriyel lakkaz yüksek sıcaklık ve pH'larda stabildir. Lakakz'ın birçok biyoteknolojik ve endüstriyel uygulamaları vardır. Bu çalışmanın amacı lakkaz pozitif yerel bir izolat olan Bacillus subtilis OH 67'nin lakkaz enzimini klonlamak, eksprese etmek, saflaştırmak, boya giderici kapasitesi araştırmak ve karakterize etmektir. Lakkaz pozitif suş (Bacillus subtilis OH 67) İstanbul-Türkiye'den izole edilmiştir. Bakteri DNA'sı PCR ve klonlama için kullanılmıştır. PCR ürünü (855bp), uygun ekspresyon vektörüne (pET22 b) aktarıldıktan sonra konak hücresinde (E. coli BL21 (DE3)) transforme edilmiştir. DNA kodlayan lakkaz gen dizisi birçok bakteri türü ile karşılaştırılmış ve Bacillus subtilis ile %99 ve diğer bakteri türleri ile %87-%99 arasında benzerlik göstermiştir. Rekombinant lakkaz aktivitesi Guaiachol oksidasyonu ile araştırılmıştır. SDS-PAGE uygulaması sonucu enzimin moleküler ağırlığı 34 kDa olmuştur. Optimum pH ve sıcaklık sırayla 6,6 ve 50°C olmuştur. Rekombinant lakkaz 40 °C ve 60 °C'de %91 ve %90 aktivite göstermiştir. Enzimin Km ve Vmax değerleri 110,7721 µM ve 19,3 µmol/min/mg olmuştur. Lakkazın boya giderim potansiyeli 16 farklı boya üzerinde incelenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları saflaştırılmış lakkazın CuSO4'ün varlığında endüstriyel ve kimyasal boyaların gideriminde güçlü bir şekilde etkili olduğunu göstermiştir. Lakkaz aktivitesi FeSO4 (5mM) 'ın ilavesiyle artmıştır. Rekombinant lakkaz 1mM'lık EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2 ve ZnCl2 tarafından orta derecede inhibe edilmiştir. Ayrıca 5 mM konsantrasyondaki SDS, HgCl2, üre, 2-merkaptoetanol, Tween-80 lakkaz aktivitesini %50'nin altına düşürmüştür. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre E. coli'de rekombinant lakkaz enzimin üretimi endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir aday olduğunu ortaya koymuştur. Enzim yüksek sıcaklıklarda aktivitesini korumuştur. Sonuç olarak, enzim modifikasyona değer ve gelecekte endüstrinin farklı alanlarında kullanılabilir.
Özet (Çeviri)
Bacterial laccases are very stable at high temperature and pH values. Laccase has many biotechnological and industrial applications. This research was aimed to clone, express, purify, characterize, and decolorization activity of the laccase from a local isolate Bacillus subtilis OH 67. The laccase positive strain (Bacillus subtilis OH 67) was isolated from Istanbul-Turkey. PCR product (Laccase gene) was transformed to E. coli BL21 (DE3) after ligation to pET22b vector. DNA sequence of laccase gene has a 99% similarity with Bacillus subtilis, but the other strains identity was among 87%-99%. The molecular weight of recombinant laccase was assigned as 34 kDa. Optimum pH and temperature of recombinant laccase was 6,6 and 50oC. Recombinant laccase exhibited 91% and 90% activity at 40°C and 60°C. The Km and Vmax values of the enzyme were obtained as 110,7721 µM and 19,3 µmol/min/mg. The recombinant laccase strongly decolorized 16 types of industrial and chemical dyes. Laccase activity was increased by addition of FeSo4 (5mM). Recombinant laccase was moderately inhibited by EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2, and ZnCl2. Moreover, the recombinant laccase activity was found to be less than 50% in the presence of SDS, HgCl2, Urea, 2-Mercaptoethanol, Tween-80 at a concentration of 5mM. In conclusion, the production of recombinant laccase enzyme in E. coli proved to be a promising candidate for industrial and biotechnological applications. The enzyme maintained its activity at high temperatures. As a result, the enzyme is worthy of modification and can be used in different area of industry in the future.
Benzer Tezler
- Identification and characterization of a new mosquitocidal Bacillus sphaericus and its toxin proteins
Sivrisinek öldürücü yeni bir suş olan Bacillus sphaericus ve toksin proteinlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu
FATİH ÇAKAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
BiyoteknolojiYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FİKRETTİN ŞAHİN
- Ülkemizde çeşitli habitatlarda izole edilen Bacillus türlerinin bazı zararlı böceklerin biokontrolünde kullanılma olanakları üzerine bir araştırma
Başlık çevirisi yok
MEHLİKA HANDAN BURSALIOĞLU
- Investigtion of the kinetic parameters of extracellular alpha-amylase from Bacillus subtilis SDP1 immobilized on alginate beads
Alginat küreler üzerine immobilize edilmiş, Bacillus subtilis SDP1'den elde edilen alpha-amilazın kinetik parametrelerinin araştırılması
EDA BAL
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
BiyoteknolojiMarmara ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK KAZAN
- Küçükbaş hayvan derilerindeki ılımlı halofil bakterilerin karakterizasyonu
Characterization of moderately halophilic bacteria found on the sheep and goat skins
PINAR ÇAĞLAYAN
Doktora
Türkçe
2015
BiyolojiMarmara ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MERAL BİRBİR
PROF. DR. ANTONIO VENTOSA
- Antimikrobiyal etkili yeni indol türevi bileşiklerin sentezleri ve biyolojik aktivitelerinin değerlendirilmesi
Synthesis and biological activitie evaluation of new antimicrobial indole derivatives
ÖZLEM ÖZTÜRK CEYLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
BiyoteknolojiAnkara ÜniversitesiTemel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SİBEL SÜZEN