Bacillus subtilisten lakkaz enzim izolasyonu, üretici genin klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve boya gideriminde etkinliğinin araştırılması
Izolation, cloning, characterization, and investigation of dye decolorization activity of laccase enzyme from Bacillus subtilis
- Tez No: 638625
- Danışmanlar: PROF. DR. NAZİME MERCAN DOĞAN, PROF. DR. SADIK DİNÇER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Pamukkale Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 100
Özet
Bakteriyel lakkaz yüksek sıcaklık ve pH'larda stabildir. Lakakz'ın birçok biyoteknolojik ve endüstriyel uygulamaları vardır. Bu çalışmanın amacı lakkaz pozitif yerel bir izolat olan Bacillus subtilis OH 67'nin lakkaz enzimini klonlamak, eksprese etmek, saflaştırmak, boya giderici kapasitesi araştırmak ve karakterize etmektir. Lakkaz pozitif suş (Bacillus subtilis OH 67) İstanbul-Türkiye'den izole edilmiştir. Bakteri DNA'sı PCR ve klonlama için kullanılmıştır. PCR ürünü (855bp), uygun ekspresyon vektörüne (pET22 b) aktarıldıktan sonra konak hücresinde (E. coli BL21 (DE3)) transforme edilmiştir. DNA kodlayan lakkaz gen dizisi birçok bakteri türü ile karşılaştırılmış ve Bacillus subtilis ile %99 ve diğer bakteri türleri ile %87-%99 arasında benzerlik göstermiştir. Rekombinant lakkaz aktivitesi Guaiachol oksidasyonu ile araştırılmıştır. SDS-PAGE uygulaması sonucu enzimin moleküler ağırlığı 34 kDa olmuştur. Optimum pH ve sıcaklık sırayla 6,6 ve 50°C olmuştur. Rekombinant lakkaz 40 °C ve 60 °C'de %91 ve %90 aktivite göstermiştir. Enzimin Km ve Vmax değerleri 110,7721 µM ve 19,3 µmol/min/mg olmuştur. Lakkazın boya giderim potansiyeli 16 farklı boya üzerinde incelenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları saflaştırılmış lakkazın CuSO4'ün varlığında endüstriyel ve kimyasal boyaların gideriminde güçlü bir şekilde etkili olduğunu göstermiştir. Lakkaz aktivitesi FeSO4 (5mM) 'ın ilavesiyle artmıştır. Rekombinant lakkaz 1mM'lık EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2 ve ZnCl2 tarafından orta derecede inhibe edilmiştir. Ayrıca 5 mM konsantrasyondaki SDS, HgCl2, üre, 2-merkaptoetanol, Tween-80 lakkaz aktivitesini %50'nin altına düşürmüştür. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre E. coli'de rekombinant lakkaz enzimin üretimi endüstriyel ve biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir aday olduğunu ortaya koymuştur. Enzim yüksek sıcaklıklarda aktivitesini korumuştur. Sonuç olarak, enzim modifikasyona değer ve gelecekte endüstrinin farklı alanlarında kullanılabilir.
Özet (Çeviri)
Bacterial laccases are very stable at high temperature and pH values. Laccase has many biotechnological and industrial applications. This research was aimed to clone, express, purify, characterize, and decolorization activity of the laccase from a local isolate Bacillus subtilis OH 67. The laccase positive strain (Bacillus subtilis OH 67) was isolated from Istanbul-Turkey. PCR product (Laccase gene) was transformed to E. coli BL21 (DE3) after ligation to pET22b vector. DNA sequence of laccase gene has a 99% similarity with Bacillus subtilis, but the other strains identity was among 87%-99%. The molecular weight of recombinant laccase was assigned as 34 kDa. Optimum pH and temperature of recombinant laccase was 6,6 and 50oC. Recombinant laccase exhibited 91% and 90% activity at 40°C and 60°C. The Km and Vmax values of the enzyme were obtained as 110,7721 µM and 19,3 µmol/min/mg. The recombinant laccase strongly decolorized 16 types of industrial and chemical dyes. Laccase activity was increased by addition of FeSo4 (5mM). Recombinant laccase was moderately inhibited by EDTA, MgCl2, CuCl2, NiCl2, MnCl2, CaCl2, and ZnCl2. Moreover, the recombinant laccase activity was found to be less than 50% in the presence of SDS, HgCl2, Urea, 2-Mercaptoethanol, Tween-80 at a concentration of 5mM. In conclusion, the production of recombinant laccase enzyme in E. coli proved to be a promising candidate for industrial and biotechnological applications. The enzyme maintained its activity at high temperatures. As a result, the enzyme is worthy of modification and can be used in different area of industry in the future.
Benzer Tezler
- Bacillus subtilis'ten izole edilen alfa-amilazın aktivitesi üzerine (H+) etkisi
The Effect of (H+) 0n alfa-amilase activity isolated from bacillus subtilis
GÜNAY TURMUŞ
- Bacillus subtilis'ten termostabil lipaz üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of a thermostable lipase from Bacillus subtilis
DENİZ TANRISEVER
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
BiyoteknolojiÇukurova ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HATİCE KORKMAZ GÜVENMEZ
- Bacillus subtilis'ten antifungal ve antibakteriyal antibiyotiklerin üretimi ve etki spektrumlarının tespiti
Başlık çevirisi yok
MUSTAFA ERHAN YILDIZ
Yüksek Lisans
Türkçe
1997
BiyomühendislikEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SANVER EKMEKÇİ
- Bacillus subtilis ve B. thuringiensis izolatlarının biyolojik iyileştirme potansiyellerinin tatlı sularda kontrollü koşullarda araştırılması
The investigation of biological improvement potentials of Bacillus subtilis and B. thuringiensis isolates under controlled conditions in freshwater
AYŞE KALAYCI
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiSu Ürünleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GONCA ALAK