Geri Dön

Evolutionary engineering of freeze-thaw stress-resistant yeasts without using chemical mutagenesis

Donma-erime stresine dirençli mayaların kimyasal mutajen kullanılmadan evrimsel mühendislik ile elde edilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 807476
  2. Yazar: İREM BALABAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 59

Özet

Ekmek mayası olarak da bilinen Saccharomyces cerevisiae, mantar krallığından tek hücreli bir mikroorganizmadır. İnsanlık tarihi boyunca şarap yapımında, bira yapımında ve ekmek pişirmede sürekli olarak kullanılmıştır. 1930'lardan sonra ürün kalitesi yüksek maya suşları elde etmek için laboratuvar çalışmalarında kullanılmıştır. Günümüzde S. cerevisiae, yüksek fermentasyon yeteneğinden dolayı en popüler maya türüdür. Endüstriyel uygulamalarda fermentasyon performansı yüksek ve çevresel streslere karşı toleranslı S. cerevisiae suşları tercih edilmektedir. Ekmek üretimi sırasında maya hücreleri, donma-çözülme, yüksek şeker konsantrasyonları, havada kurutma ve oksidatif stres gibi çeşitli çevresel streslere maruz kalır. Stres koşulları; hücre büyüme hızında, ürün veriminde ve kalitesinde düşüşe neden olur. Hücreler, çevresel stres yanıtı (ÇSY) ve strese özgü yanıt olarak stres koşullarına cevap verir. ÇSY mekanizması stres faktörüne özgü değildir ve maya hücrelerinin çeşitli stress faktörlerine karşı gösterdiği çapraz direnci açıklamak için kullanılabilir. Çapraz direncin ortaya çıkmasının nedenlerinden biri, aynı transkripsiyon faktörlerinin farklı streslere yanıt olarak kullanılmasıdır. S. cerevisiae, kriyoprezervasyon ve dondurulmuş hamur işlemi sırasında donmaçözülme stresine maruz kalmaktadır. Donma-çözülme stresi hücrelerde fizyolojik yaralanmalara neden olur. Yüksek donma hızlarında hücre içi buz kristallerinin oluşumu hücresel hasarlara neden olur; düşük donma hızlarında ise hücre dışı buz kristallerinin oluşumu hücresel dehidrasyona neden olur. Çözdürme işlemi, hücre içindeki proteinler, nükleik asitler ve diğer biyomoleküller üzerinde oksidatif hasarlara yol açar ve oksidatif strese neden olur. S. cerevisiae'nın donma çözülme stresine karşı strese özgü yanıtı üzerine yürütülen araştırmalar, hücrelerin stres karşısında hücre zarı içeriğini düzenlemeye, hücre duvarı bütünlüğünü korumaya, stresten zarar görmüş proteinlerin bozulmasını artırmaya ve genel protein sentezini artırmaya odaklandığını ortaya çıkarmıştır. Donma koşulları altında buz kristali oluşumunu azaltmak için kriyoprotektif maddeler eklenebilir. Alternatif olarak, ürün verimini artırmak için üründeki maya miktarı artırılabilir. Ancak bu yöntemler ürün kalitesini düşürebilir ve maliyeti artırabilir. Bu nedenle endüstriyel uygulamalarda strese dayanıklı S. cerevisiae suşları tercih edilmektedir. Strese dayanıklı suşlar, metabolik mühendislik ile elde edilebilir. Evrimsel mühendislik, doğal evrim sürecini taklit eden bir tersine metabolik mühendislik yöntemidir. Bu yaklaşımda önce istenen fenotip seçilir ve fenotipten sorumlu genler daha sonra tersine mühendislik yöntemleriyle belirlenir. Bu çalışmada, donma-erime stresine dirençli maya suşları, evrimsel mühendislik yöntemiyle elde edildi. Referans laboratuvar suşu, kısa süreli şok (pulse) stres seçilimi şeklinde donmaçözülme stresine maruz bırakıldı. Stres koşulları altında elde edilen dirençli suşlar, genel olarak stresle indüklenen genlerinde mutasyonlar gösterir. Bu durum, uygulanan stresle ilgili genlerin belirlenmesi için tersine mühendislik çalışmalarında kolaylık sağlar. Artan stres seviyeleri ile hücrelerin hayatta kalma oranını korumak ve stresin seçici etkisini arttırmak için donma-çözülme stresi kısa süreli şok (pulse) stres seçilimi şeklinde uygulandı. Bu çalışmada, bir Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D referans suşu, son poülasyon elde edilene kadar kademeli olarak artan donma-çözülme stresine maruz bırakıldı. 10 döngü donma-çözülme stresi uygulandıktan sonra son popülasyon elde edildi. Son popülasyondan rastgele 10 mutant birey seçildi ve donma-çözülme stresine karşı dirençleri nokta tahlili (spot assay) yöntemi ile test edildi. En yüksek düzeyde donma-çözülme direnci gösteren FT-1, FT-5, FT-6 ve FT-9 adlı dört suş kapsamlı analizler için seçildi. Dirençli suşların diğer fizyolojik karakterizasyonları, çapraz direnç analizi ile yapılmıştır. FT-1, FT-6 ve FT-9 suşları, potasyum klorür (KCl) ve demir stresine karşı çapraz direnç gösterdi. KCl, yüksek konsantrasyonlarda hücrede hiperozmotik strese neden olur. Bu çapraz direnç, donma stresinin neden olduğu dehidrasyondan kendini korumak için hücre tarafından etkinleştirilen benzer bir tepki mekanizmasının sonucu olabilir. Demir ve benzeri metaller hücrede ROS üretimini arttırır ve oksidatif strese neden olur. Demire karşı çapraz direnç, hücre tarafından çözülme işleminin neden olduğu oksidatif strese bir yanıt olarak kullanılan benzer yolakların aktivasyonunun bir sonucu olabilir. Test edilen tüm dirençli suşlar borik aside direnç göstermiştir. Borik asit, S. cerevisiae'de hücre duvarı sentezini bozar. Dondurma işlemi ayrıca S. cerevisiae'de hücre duvarı hasarına neden olur. Donma stresi nedeniyle hücre duvarı sentezinin indüklenmesi, borik aside karşı direncin artmasıyla da sonuçlanabilir. Bu çalışmanın amacı, bir referans laboratuvar suşundan, donma-çözülme stresine dirençli S. cerevisiae suşlarının, kimyasal mutajenez uygulamadan, evrimsel mühendislik ile elde edilmesidir. Seçilen stres faktörlerine karşı çapraz dirençlerini belirleyerek dirençli suşların fizyolojik karakterizasyonu da gerçekleştirilmiştir. Donma-çözülme stresine karşı dirençten sorumlu genleri, yolakları, moleküler mekanizmaları ve seçilen kimyasallara karşı çapraz dirence neden olan yolakları belirlemek için, seçilen FT-9 suşu üzerinde kapsamlı genomik, transkriptomik ve proteomik analizler yapılabilir

Özet (Çeviri)

Saccharomyces cerevisiae, also known as budding yeast or baker's yeast is a unicellular microorganism from the fungi kingdom. It has been consistently used in winemaking, brewing and baking bread throughout human history. After 1930s, laboratory studies were conducted to obtain strains with increased product quality. Today, S. cerevisiae is the most popular yeast strain due to its good fermentative abilities. S. cerevisiae with high fermentation performance and tolerance to environmental stresses is preferred for industrial applications. During bread production, yeast cells are exposed to a variety of environmental stresses including freeze–thaw, high sugar concentrations, air-drying and oxidative stress. Stress conditions cause a decline in cell growth rate, product yield and quality. Cells give responses to stress conditions, as environmental stress response (ESR) and stress-specific response. ESR mechanism is not specific to the stress factor and it can be used to explain the cross-resistance of the yeast cells against various stress types. One of the reasons for cross-resistance is the use of the same transcription factors as a response to a variety of different stresses. S. cerevisiae is exposed to freeze-thaw stress during the cryopreservation and frozen dough process. Freeze-thaw stress causes physiological injuries to cells. At high freezing rates, formation of intracellular ice crystals causes cellular damages; while at low freezing rates formation of extracellular ice crystals causes cellular dehydration. The thawing process causes oxidative stress which leads to oxidative damage on proteins, nucleic acids and other biomolecules inside the cell. Studies conducted in S. cerevisiaes' stress-specific response against freeze-thaw stress revealed cells focus on regulating the contents of the cell membrane, protecting cell wall integrity, increasing degradation of damaged proteins from stress and increasing overall protein synthesis under stress conditions. Cryoprotective agents can be added to decrease ice crystal formation under freezing conditions. Alternatively, yeast levels in the product can be increased to increase product yield. However, these methods can decrease product quality and increase cost. Thus, stress-resistant S. cerevisiae strains are preferred for industrial applications. Stress-resistant strains can be obtained by metabolic engineering. Evolutionary engineering is an inverse metabolic engineering method that mimics the natural evolution process. In this approach, the desired phenotype is selected first and the genes responsible for the phenotype are determined later by reverse engineering methods. In this study, freeze-thaw resistant yeast strains were obtained with the evolutionary engineering method. A reference yeast strain was exposed to freeze-thaw stress in the form of pulse stress selection. The evolved strains obtained under stress conditions generally show mutations mainly in their stress-induced genes. This allows ease in reverse engineering studies to determine genes related to the applied stress. Freeze-thaw stress was applied in the form of pulse stress selection to maintain the survival rate of cells with increasing stress levels and to induce selective pressure. In this study, a S. cerevisiae CEN.PK113-7D reference strain was exposed to gradually increasing freeze-thaw stress until the final population was obtained. The final population was obtained after 10 cycles of freeze-thaw stress application. Ten mutant individuals were randomly selected from the final population and their resistance to freeze-thaw stress was tested with the spot assay method. Four evolved strains labeled as FT-1, FT-5, FT-6 and FT-9 that showed the highest freeze-thaw resistance were selected for detailed analysis. Further physiological characterizations of the evolved strains were made by crossresistance analysis. FT-1, FT-6 and FT-9 showed cross-resistance to potassium chloride (KCl) and iron stress. KCl, at high concentrations, causes hyperosmotic stress to the cell. This cross-resistance could be the result of a similar response mechanism activated by the cell to protect itself from dehydration caused by freezing stress. Metals such as iron increase generation of ROS in cell and cause oxidative stress. The crossresistance to iron stress could be the result of activation of similar pathways used by the cell as a response to oxidative stress caused by thawing process. All evolved strains tested showed resistance to boric acid. Boric acid disrupts cell wall synthesis in S. cerevisiae. The freezing process also causes cell wall damage in S. cerevisiae. Inducing cell wall synthesis due to freezing stress may also result with increased resistance to boric acid. The aim of this study was to obtain freeze-thaw stress-resistant S. cerevisiae strains from a reference laboratory strain, without using chemical mutagenesis, by evolutionary engineering. Physiological characterization of the evolved strains was also performed by determining their cross-resistance to selected stress factors. Further genomic, transcriptomic and proteomic analyses could be performed on the selected FT-9 strain to identify the genes, pathways and molecular mechanisms responsible for resistance against freeze-thaw stress and the pathways that cause cross-resistance to selected stress factors.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    878667

    Genomic analysis of freeze-thaw stress-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Donma-erime stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin genomik analizi

    ÇAĞLA GÜNEY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    352299

    Evolutionary engineering and molecular characterization of freeze-thaw resistant Saccharomyces cerevisiae

    Donma-erime stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae nin evrimsel mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu

    ÜLKÜ YILMAZ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    876220

    Chronological lifespan analysis of stress-resistant yeasts

    Strese dirençli mayaların kronolojik yaşam sürelerinin analizi

    ASLI NUR AKAYDIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    737560

    Comparative whole genome sequencing and bioinformatic analysis of afreeze-thaw stress-resistant, industrial Saccharomyces cerevisiae strain

    Donma-erime stresine dirençli bir endüstriyel Saccharomyces cerevisiae suşunun karşılaştırmalı tüm genom dizileme ve biyoinformatik analizi

    BURCU TUĞBA ŞİMŞEK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  5. Tez No

    295330

    Characterization of freeze-tolerant Saccharomyces cerevisiae obtained by evolutionary engineering

    Evrimsel mühendislik ile elde edilen donmaya dirençli Saccharomyces cerevisiae?nin karakterizasyonu

    NECLA SENA ALİKİŞİOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

Geri Dön