Geri Dön

Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu

Cloning of enolase gene without intron, expression, purification and kinetic characterization of the enzyme from Theileria annulata

PDF İndir

  1. Tez No: 329618
  2. Yazar: EBRU ÇAYIR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. DİLEK BALIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biyomühendislik, Genetik, Biochemistry, Bioengineering, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2013
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 126

Özet

Tropikal theilorisis, Hyalomma cinsi kenelerce taşınan apikompleksan paraziti Theileria annulata aracılığıyla yüksek verimli sığırlarda enfeksiyona ve yüksek oranda morbidite ve mortaliteye neden olmaktadır. Bu nedenle tropikal theilorisis büyük ekonomik kayıplara neden olan yaygın ve önemli bir hastalıktır. Son yıllarda parazitin hastalığın tedavisinde kullanılan en etkin ilaca karşı direnç geliştirdiği bildirilmiştir. Bu durum, alternatif tedavi yöntemlerine ihtiyaç doğurmuştur. Glikolizis, Theileria annulata'nın ATP eldesinde, canlılığı ve virülansında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle bu yolak, antitheilerial ilaçlar için aday olan hedeflerdendir. Enolaz 2-fosfogliserikasidin (2-PGA) ve fosfoenolpirüvatın (PEP) tersinir dönüşümünü katalizleyen kilit bir glikolitik enzimdir. Ayrıca, son yayınlar ile enolazın, bazı patojenik organizmaların hücre yüzeyinde ifade edildiği belirtilmiştir. Hücre yüzeyindeki enolaz, plazminojen bağlanma reseptörü olarak görev almakta ve dokuya invazyonda önemli bir rol oynamaktadır. Enolaz, Theileria annulata için kilit bir glikolitik enzim ve plazminojen bağlanma reseptörü olması olmasından dolayı, tropikal theilorisis tedavisinde makromoleküler bir hedef olarak seçilebilir. Bu çalışmada Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan gendeki intron dizisi PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez ile uzakkalştırılmış ve bu gen pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır. İntronun uzaklaştırılması DNA dizi analizi ile onaylanmıştır. Bu gen daha sonra C-terminalinde 6 Histag kuyruğu içeren pLATE31 vektörüne altklonlamış ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde ifade edilmiştir. İfade edilen enzim Ni-NTA agaroz kolon kullanılarak afinite kromatografisi aracılığıyla saflaştırılmıştır. Enzime ait kararlı hal kinetik verileri GraFit 3.0 ile tanımlanmıştır. Theileria annulata'ya ait RNA örneğinin yokluğundan dolayı, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı çalışmalarına uygun olacak aktif enzimin üretilmesi için, gendeki intron dizisinin uzaklaştırılmasında PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez kullanılarak bir strateji geliştirilmiştir. Bilgimiz dahilinde, bu çalışma orjinal intron dizisini içeren genden aktif enzimin üretilmesi amacıyla ilk kez uygulanmıştır. Aktif enzimin ifadesi ve saflaştırılması yeni ilaç tasarım çalışmaları ve hastalığın yok edilme stratejileri için önemlidir. İntron uzaklaştırılmasını takiben saf rekombinant Theileria annulata enolazının yüksek miktarda eldesi (30 mg/litre kültür) yüksek saflık derecesinde (>% 95) sağlanmıştır. Saflaştırılan proteinin molekül ağırlığı SDS-PAGE'te amino asit sekansından hesaplanan kütle doğrulaması ile yaklaşık olarak 48 kDa büyüklüğünde tek bant vermiştir. 2-PGA'nın substrat olarak kullanıldığı enzim aktivite ölçümleri, spesifik aktivite değerini 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 ve kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1 olarak vermiştir. Bu değerler bu parazit için ilk defa tanımlanmıştır ve enolaz enziminin büyük miktarlarda eldesi yeni antitheilerial ilaçların tasarımına yönelik daha ileri kinetik ve yapısal karakterizasyon çalışmalarına olanak sağlayacaktır.

Özet (Çeviri)

Tropical theileriosis is caused by infection with the apicomplexan parasite Theileria annulata that is spread by ticks of the genus Hyalomma and high rate morbidity and mortality in high efficiency cattle. Thus, tropical theileriosis is a common and important disease causing huge economic losses. In recent years, parasite resistance has been reported to most effective antitheilerial drug used for the treatment of this disease. This situation has given rise to the need for alternative methods of treatment. Glycolysis play crucial roles in the ATP supply, important for the viability and virulence of Theileria annulata. This pathway is, therefore, candidate targets for antitheilerial drugs. Enolase is a key glycolytic enzyme that catalyzes the inter conversion of 2-phosphoglycericacid (2-PGA) and phosphoenolpyruvate (PEP). Also, recent reports described that enolase expressed at the cell surface of several pathogenic organisms. The surface enolase acts as a plasminogen-binding receptor and plays an important role in tissue invasion. Since enolase is a key glycolytic enzyme and plasminogen-binding receptor for Theileria annulata, enolase can be selected as a macromolecular target of therapy of tropical theileriosis. In this study, an intron sequence present in Theileria annulata enolase enzyme gene was removed by PCR site directed mutagenesis and the gene was cloned into pGEM-T Easy vector. Removal of intron sequence was confirmed by DNA sequencing. The gene was than subcloned into pLATE31 vector, having an C-terminal 6xHistaged sequence, and exspressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. The enzyme was purified by affinity choromatography using Ni-NTA agarose coloumn. Staedy state kinetic parameters of the enzyme was determined using GraFit 3.0. Because of lack of RNA sample from Theileria annulata, a strategy has been design by using PCR site directed mutagenesis for removal of an intron sequence from a gene with the ultimate aim of producing active enzyme that will be available for structure based drug design studies. To our knowledge, present study is first to be applied with the aim of production of active protein from a gene that originally had an intron sequence. Expression and purification of active enzyme is of importance for novel drug design research and strategies to overcome the diseases. High quantities (30 mg per liter culture) of pure recombinant Theileria annulata enolase has been obtained in a higly purified form (> 95 %) following intron removal. Molecular weight of purified protein gave a single band on SDS-PAGE at about 48 kDa that is in aggrement with the mass calculated from the amino acid sequence. Enzyme kinetic measurements using 2-PGA as substrate gave a specific activity of 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 and kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1. These values have been determined for the first time from this parasite and availability of large quantities of enolase enzyme will facilitate further kinetic and structural characterization towards design of new antitheilerial drugs.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    295765

    Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin ilaç ve aşı tasarım çalışmalarında kullanılmak üzere izolasyonu, klonlanması ve analiz edilmesi

    Isolation, cloning and analysis of the gene encoding enolase from Theileria annulata for drug and vaccine designing studies

    AYBERK AKAT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    BiyomühendislikYıldız Teknik Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. DİLEK TURGUT-BALIK

  2. Tez No

    533832

    Bos taurus enolaz enzimini kodlayan genin yapıya dayalı ilaç tasarımı yönünde moleküler ve enzimatik analizlerinin yapılması

    Structural, molecular and enzymatic analysis of Bos taurus enolase towards structure-based drug design

    EMRAH SARIYER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyomühendislikYıldız Teknik Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. DİLEK TURGUT BALIK

    DOÇ. DR. ÖZKAN DANIŞ

  3. Tez No

    295761

    Theileria annulata'nın laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin ilaç tasarım çalışmalarında kullanılmak üzere izolasyonu, klonlanması ve analizi

    Isolation, cloning and analysis of the enyzme encoding lactate dehydrogenase gene from Theileria annulata for drug design studies

    AYŞEGÜL ERDEMİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    BiyomühendislikYıldız Teknik Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. DİLEK TURGUT-BALIK

  4. Tez No

    759379

    Theileria annulata'nın hücre kültürü pasajlarında atenüasyon düzeylerinin moleküler belirteçler ile incelenmesi

    Investigation of attenuation levels of theileria annulata in cell culture passages with molecular markers

    BERİL KOÇ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    ParazitolojiAydın Adnan Menderes Üniversitesi

    Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HÜSEYİN BİLGİN BİLGİÇ

    PROF. DR. TÜLİN KARAGENÇ

  5. Tez No

    845025

    Theileria annulata ile doğal enfekte sığırların dolaşımındaki Eksozomal Mikrorna'ların karakterizasyonu, ekspresyon profilleri ve fonksiyonel önemleri

    Characterization, expression profiles and functional importance of Exosomal Micrornas in the circulation of naturally infected cattle with Theileria annulata

    SADULLAH USLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Veteriner HekimliğiErciyes Üniversitesi

    Veterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖNDER DÜZLÜ

Geri Dön