Geri Dön

Comparison of human growth hormone production performances of two different metabolically engineered Pichia pastoris

İki farklı metabolik mühendislik yaklaşımıyla geliştirilen Pichia pastoris hücrelerinin insan büyüme hormonu üretim performanslarının karşılaştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 338410
  2. Yazar: HALİME GÜL ZERZE
  3. Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2012
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 197

Özet

Bu çalışmada, iki farklı recombinant Pichia pastoris suşunun, rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) üretim performansları karşılaştırılmış ve biyoproses karakteristikleri araştırılmıştır. Bu kapsamda, birinci-araştırma programında, önceden geliştirilmiş, metanolle indüklenen alkol oksidaz I (AOX1) geni altında rhGH üretimi yapan P. pastoris M13 (pPICZ?A::hGH-Mut+) suşu ile üç farklı mannitol ve metanol besleme stratejisi (MM1, MM2 ve MM3) uygulanmıştır. MM1 stratejisinde, yarı-kesikli metanol µM0=0.03 st-1 spesifik çoğalma hızında beslenirken, ikinci substrat mannitol t=0, 8, ve 15 st'lerde pulse-besleme ile (kesikli) eklenerek derişimi 50 g L-1 çıkarılmıştır. MM2 stratejisinde, t=0st'da 50 g L-1 başlangıç mannitol derişimi ile başlanmış ve t=6st'a kadar sürekli mannitol beslemesi yapılarak yarı-kesikli biyoreaktörde mannitol derişimi 50 g L-1' de tutulmuş; sonraki periyotta t=19.5 st'e kadar önceden-belirlenmiş µM0=0.03 st-1 değeri için metanol beslemesi yapılmış; ve son periyotta t=19.5 st'ta kesikli metanol eklemesi yapıldıktan sonra µ=0.03 st-1 değerinde sabit tutmak için, dinamik metanol beslemesi uygulanmıştır. MM3 stratejisinde, MM2'yle aynı mannitol beslemesi yapılmış; ancak, buna ek olarak metanol t=12 st'e kadar µM0=0.03 h-1 ile beslenmiş t>12 st'te µ=0.03 h-1 sabit olacak şekilde dinamik metanol beslemesi yapılmıştır. Bu deneylerin hücre, metanol, mannitol, organik asit ve rhGH derişimleri ile , AOX ve proteaz aktiviteleri deneysel olarak ölçülmüştür. En yüksek hücre derişimi MM3'te CX=157 g L-1 olarak elde edilirken, en yüksek rhGH derişimi MM2 stratejisinde CrhGH=1.2 g L-1 olarak elde edilmiştir. Veriler kullanılarak, substrat ve hücreye göre, en yüksek ürün verimleri MM2 stratejisinde, YP/St=4.02 mg g-1 ve YP/X=10.67 mg g-1 olarak bulunmuştur.İkinci-araştırma programında, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAP) geni altında yapısal rhGH ekspresyonu yapan rekombinant sistem tasarlanmış ve rekombinant P. pastoris G7 suşu oluşturulmuştur. En yüksek rhGH üretim potansiyeline sahip mikroorganizma seçildikten sonra, bu suşla rhGH üretimini araştırmak ve geliştirmek için G1 ve G2 olarak adlandırılan, glukoz ile iki farklı yarı-kesikli-biyoreaktör besleme stratejisi uygulanmıştır. G1 stratejisinde, t=6 st'e kadar µG0=0.2 st-1 değeri için kalma süresine karşı önceden-belirlenmiş glukoz çözeltisi değişken debisinde glukoz beslemesi yapılmış; sonraki periyotta t=6 st'ta basamak düşüş ile µG0 değeri µG0=0.03 st-1 düşürülerek, t>6 st için önceden-hesaplanmış Q(t) debilerinde glukoz beslenmesine devam edilerek yarı-kesikli işletim sürdürülmüştür. G1 bulguları değerlendirilerek tasarlanan G2 stratejisinde, t=3st'e kadar µG0=0.2 st-1 değeri için önceden-hesaplanmış Q(t) debilerinde glukoz beslemesi sürekli yapılmış; ikinci periyotta, t>3 st için sabit akış hızında glukoz beslemesi yapılarak yarı-kesikli işletim uygulanmıştır. En yüksek CX ve CrhGH, 90 g L-1 ve 0.2 g L-1 olarak, ve en yüksek hücre ve ürün verimleri YX/S, YP/S, ve YP/X değerleri, sırasıyla, 0.48 g g-1, 1.21 mg g-1 ve 2.53 mg g-1 olarak G2 yarı-kesikli işletim stratejisinde elde edilmiştir.

Özet (Çeviri)

Recombinant human growth hormone (rhGH) production levels and bioprocess characteristics were investigated for two recombinant Pichia pastoris strains. In the first part of the study, feeding strategies for semi-batch operations were developed in pilot scale bioreactors to improve rhGH production under strong methanol inducible alcohol oxidase I (AOX1) promoter, by previously constructed P. pastoris M13 strain (pPICZ?A::hGH-Mut+). Three different methanol feeding strategies together with mannitol co-feeding named as MM1, MM2 and MM3 were performed. In MM1, methanol was fed to the bioreactor with a pre-determined specific feeding rate of µM0=0.03 h-1; whereas, three pulses of mannitol was introduced at t=0, 8, and 15 h and the mannitol concentration in the bioreactor increased to 50 g L-1. In MM2, the semi-batch bioprocess was started with 50 g L-1 mannitol concentration at t=0 h and kept constant at this concentration until t=6 h; in the following period until t=19.5 h, methanol was fed with a pre-determined specific feeding rate for µM0=0.03 h-1; and then in the third period, by t=20 h dynamic methanol feeding was employed for constant µ=0.03 h-1. In MM3, the same mannitol feeding strategy was performed as in MM2, together with the pre-determined methanol feeding for µM0=0.03 h-1, until t=12 h; thereafter, for constant µ=0.03 h-1 dynamic methanol was feeding employed. Throughout the experiments, the cell, mannitol and methanol concentrations, rhGH, and organic acid concentrations; AOX and protease activities were experimentally determined. The highest rhGH concentration was obtained in the MM2 strategy as CrhGH=1.2 g L-1; whereas the highest cell concentration was reached in MM3 as CX=157 g L-1. Further, the highest overall product yields on substrate and cell, YP/St and YP/X, were obtained in MM2 respectively as 4.02 mg g-1 and 10.67 mg g-1.In the second part of study, recombinant P. pastoris G7 strain, which provides constitutive rhGH expression under glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) promoter, was designed and constructed. After selection (how?) of the microorganism having the highest production potential (G7), two different glucose feeding strategy, namely G1 and G2, were employed to investigate and improve the rhGH production. In G1, glucose was fed with the pre-determined µG0=0.2 h-1 until t=6 h; where, with a step-down operation the pre-determined µG0 decreased to µG0=0.03 h-1 throughout the bioprocess. Based on the findings of the G1 strategy, in G2, glucose was fed with the pre-determined specific growth rate of µG0=0.2 h-1 until t=3 h; and than proceeded with constant glucose feeding. The highest CX and CrhGH were obtained as 90 g L-1 and 0.2 g L-1 in G2; moreover, the overall yield coefficients YX/S, YP/S, and YP/X were obtained, respectively, as 0.48 g g-1, 1.21 mg g-1, and 2.53 mg g-1.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    463601

    Effect of signal sequences and promoters in recombinant extracellular protein production by Pichia pastoris

    Sinyal dizinlerin ve promotorların Pichia pastoris ile hücre-dışı rekombinant protein üretimine etkisi

    ASLAN MASSAHI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ D. SON

  2. Tez No

    489448

    Therapeutic protein production and its separation by zeolitic imidazolate framework–8 adsorbent

    Terapötik protein üretimi ve zeolitik imidazol kafes-8 yapılı adsorban ile ayrılması

    YİĞİT AKGÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. HALİL KALIPÇILAR

  3. Tez No

    695482

    Over granüloza hücrelerindeki steroid biyosentezinde görev alan kaplı vezikül sisteminin histolojik olarak incelenmesi

    Histological evaluation of coated vesicle system involved in steroid biosynthesis in ovarian granulosa cells

    AYNUR ABDULOVA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Histoloji ve Embriyolojiİstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GAMZE TANRIVERDİ

  4. Tez No

    445315

    İnvaziv meme karsinomlarında kor biyopsi ve eksizyon materyallerinin histolojik tip, histolojik grade, hormon reseptörleri ve HER2 ekspresyonu yönünden karşılaştırılması

    Comparison of core biopsy and excision specimens according to histologic TYPE, histologic grade, hormone receptor and HER 2 status in invasive breast carcinoma

    EMEL ONAYGİL

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    Patolojiİstanbul Üniversitesi

    Tıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ŞENNUR İLVAN

  5. Tez No

    845793

    Meme kanseri ve aksiller metastazı bulunan hastalarda, memedeki kitlenin immunohistokimyasal özellikleri ile aksilladaki metastatik lenfadenopatinin immunohistokimyasal özelliklerinin kalın iğne biyopsi bulguları ile karşılaştırılması

    Comparison of immunohistochemical properties of the breast mass and axillary metastatic lymphadenopathy with trucut biopsy findings in patients with breast cancer and axillary metastasis

    MUHAMMED ŞAMİL AYDIN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Radyoloji ve Nükleer TıpErciyes Üniversitesi

    Radyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERAP DOĞAN

Geri Dön