Geri Dön

Effects of CO-carbon sources in recombinant human erythropoietin production by pichia pastoris

Pichia pastoris ile rekombinant insan eritropoietin uretiminde ikinci karbon kaynaklarının etkileri

PDF İndir

  1. Tez No: 338524
  2. Yazar: ŞÜKRAN MELDA ESKİTOROS
  3. Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Rekombinant insan eritropoetini, Pichia pastoris, karbon kaynakları, besleme stratejileri, Recombinant human erythropoietin, Pichia pastoris, co-carbon sources, feeding strategy v
  7. Yıl: 2013
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 105

Özet

Bu yüksek lisans tezinde, farklı ikinci karbon kaynaklarının değişik üretim stratejileri kullanılarak, Pichia pastoris ile terapatik proteinlerden glikoprotein yapısındaki rekombinant insan eritropoietin (rHuEPO) üretimi üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Proses süresince hücre, sorbitol, mannitol, metanol, rHuEPO, AOX, proteaz ve yan ürünler olan organic asit derişimleri ölçülerek izlenmiştir.Belirtilen amaç doğrultusunda ilk olarak, mannitol ve sorbitolün ikinci karbon kaynağı olarak etkileri P. pastoris Mut+suşu kullanılarak laboratuvar ölçekli biyoreaktörlerde incelenmiştir. Kullanılan farklı başlangıç konsantrasyonları arasından, 50 g L-1 ikinci karbon kaynağı konsantrasyonun hücre derişimi ve rekombinant protein üretimi için daha ekonomik ve uygun olduğu saptanmıştır. Sonraki aşamada, altı çeşit biyoreaktör işletim stratejisi tasarlanmıştır. Tasarlanan ilk stratejide (SSM) kesikli işletimle 50 g L-1 sorbitol, üretim fazına geçiş anı t=0 st?te beslenmiş ve ardından proses boyunca yarı-kesikli işletimle önceden belirlenen özgül çoğalma hızı µM0=0.03 st-1olacak şekilde metanol beslemesiyle eşzamanlı olarak, üretim fazının t=0-15 st arasında biyoreaktördeki sorbitol derişimi 50 g L-1 değerinde, özgül çoğalma hızı µSrb0=0.025 st-1 olacakşekilde yarı-kesikli beslemeyle sabit tutulmuştur. Bunu takip eden biyoreaktör deneylerinde ikinci karbon kaynağı olan mannitol kullanılmış, her birinde metanolde özgül çoğalma hızı µM0=0.03 st-1olacak şekilde yarı-kesikli beslenmiştir. Uygulanan ikinci stratejide, (MM) yalnızca üretim fazına geçiş anı t=0 st?te 40 g L-1 mannitol eklenmiştir. Tasarlanan üçüncü stratejide (MMM), üretim fazı başında 50 g L-1 mannitolün ortama eklenmesinden sonra üretim fazında, ilk tasarlanan strateji (SSM) ile aynı hücre konsantrasyonuna gelene kadar, t=0-9 st arasında, özgül çoğalma hızı µMan0=0.11 st-1olacak şekilde mannitol konsantrasyonu 50 g L-1 de sabit tutulmuştur. Dördüncü stratejide (MLM), limit miktar olan 3 g L-1 mannitol, üretim fazına geçiş anında kesikli olarak eklenmiş, devamında üretim süresince t=0-10 st arasında özgül çoğalma hızı µMan0=0.005 st-1 olacak şekilde mannitolkonsantrasyonu 3 g L-1 de sabit tutulmuştur. Tasarlanan bu stratejilerden sonra, birden fazla kesikli mannitol eklemelerinin yapıldığı yeni besleme stratejileri geliştirilmiştir. Tasarlanan beşinci stratejide (MPM), üretim fazının t=0, 6 ve 12 st de 50 g L-1 mannitol kesikli olarak eklenmiştir. En son tasarlanan stratejide (MPMG) ise, t=0, 7, 14, ve 24 st?de dört defa kesikli olarak, 50 g L-1 mannitol ile fermentasyon ortamında 8 g L-1 olacak şekilde gliserol beslenmiştir. En yüksek rekombinant protein derişimine 645 mg L-1olarak beşinci stratejinin (MPM) t=9 st?te elde edilirken, en yüksek hücre derişimi olan 109 g L-1ye ilk strateji (SSM) ile t=48 st de ulaşılmıştır. En yüksek üretimin elde edildiği üretim koşulunda, toplam substrat üzerinden elde edilen en yüksek hücre ve ürün verimleri, sırasıyla YX/St=0.22 g g-1 ve YP/St=2.23 mg g-1olarak bulunmuştur.

Özet (Çeviri)

In this study, it was aimed to investigate the effects of different co-carbon sources on therapeutically important glycoprotein, recombinant human erythropoietin (rHuEPO) production by Pichia pastoris by designing feeding strategies which were applied in the production phase of the bioprocess. During the experiments, the cell growth, sorbitol, mannitol, and methanol consumptions, recombinant human EPO production, alcohol oxidase activity, total protease concentrations and the by-products organic acid concentrations were analyzed. In this context, firstly, laboratory scale air filtered shake bioreactor experiments were performed by P. pastoris Mut+ strain to investigate the effects of mannitol and sorbitol. 50 gL-1 initial concentration of co-substrates was found more affordable and appropriate for cell concentration and recombinant protein production. Thereafter, six pilot scale bioreactor operations were designed and performed. In the first designed strategy (named as SSM strategy), batch-wise 50 g L-1 sorbitol was fed at t=0 h of the production phase and then sorbitol concentration was kept constant at 50 g L-1 by fed-batch feeding with a pre-determined specific growth rate of µSrb0=0.025 h-1 within t=0-15 h of theproduction phase together with fed-batch methanol feeding with a pre-determined specific growth rate of µM0=0.03 h-1. In the following bioreactor experiments co-substrate mannitol was fed to the systemwith different feeding strategies together with fed-batch methanol feeding with a pre-determined specific growth rate of µM0=0.03 h-1. In the second strategy (MM), only 40 g L-1 mannitol was addedto the system at t=0 h of the production phase. In the third strategy (MMM), after adding 50 g L-1mannitol at t=0 h, mannitol concentration was kept constant at 50 g L-1 by fed-batch feeding with a pre-determined specific growth rate of µMan0=0.11 h-1 within t=0-9 h of the production phase whenthe same cell concentration was attained in SSM strategy. In the fourth one (MLM), limiting amount of mannitol, 3 g L-1, was added at t=0 h and then mannitol concentration was kept constant at 3 g L-1by fed-batch feeding with a pre-determined specific growth rate of µMan0=0.005 h-1 within t=0-10 h ofthe production phase. After these strategies, several pulses, batch-wise, mannitol feeding strategies were performed. In the fifth strategy (MPM), besides 50 g L-1 initial mannitol feeding at t=0 h, adding second batch-wise mannitol at t=6 h, and third one at t=12 h were applied. In the last strategy (MPMG), four 50 g L-1 pulse feeding of mannitol were performed at t=0 h, 7 h, 14 h, and 24 h, containing glycerol, with an initial concentration in the fermentation medium being 8 g L-1. The highest extracellular rHuEPO production was achieved in the fifth strategy MPM as CrHuEPO=645 mg L-1 at t=9 h while the highest cell concentration was achieved in the first strategy SSM as Cx=109 gL-1at t=48 h. The overall cell and product yields on total substrate were calculated as YX/St=0.22 g g-1 andYP/St=2.23 mg g-1 in the highest rHuEPO production case.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    255236

    Effects of carbon sources and feeding strategies on human growth hormone production by metabolically engineered Pichia pastoris

    Karbon kaynaklarının ve besleme stratejilerinin rekombinant Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretimine etkisi

    EDA AÇIK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER ÖZDAMAR

  2. Tez No

    371702

    A comparative study for the production of recombinant intracellular glucose isomerase by Escherichia coli and Pichia pastoris

    Rekombinant hücre içi glukoz izomeraz üretimi için Escherichia coli ve Pichia pastoris üretim potansiyellerinin kıyaslanması

    SENA YAMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Bölümü

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR

  3. Tez No

    153594

    Bioprocess operation parameters for recombinant benzaldehyde lyase production

    Rekombinant benzaldehit liyaz üretimi için biyoproses işletim parametrelerinin araştırılması

    PINAR YILGÖR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2004

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. AYHAN SITKI DEMİR

  4. Tez No

    167182

    Coleoptera-specific (CRY3Aa) delta-endotoxin biosynthesis by a local isolate of Bt subsp. Tenebrionis, gene cloning and characterization

    Bt subsp. Tenebrionis'in yerel bir izolatında kınkanatlılara karşı aktif (CRY3Aa) delta-endotoksin biyosentezi, gen klonlanması ve karakterizasyonu

    ASLIHAN KURT

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2005

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. GÜLAY ÖZCENGİZ

    Y.DOÇ.DR. MELEK ÖZKAN

  5. Tez No

    120929

    Rekombinant proteaz üretiminde biyoreaktör işletim parametrelerinin hücreiçi tepkime hızlarına ve verime etkisi

    Effect of bioreactor operation parameters on intracellular reaction rates and yield in recombinant protease production

    ESRA BİLİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2002

    Kimya MühendisliğiAnkara Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

    DOÇ. DR. PINAR ÇALIK

Geri Dön