Labeling and optimization of organelle marker for co-localization with yeast GPCR dimers
Maya GPKR dimerlerinin ko-lokalizasyonu için organel işaretleyicilerin hazırlanması ve optimizasyonu
- Tez No: 341025
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON, DOÇ. DR. CAN ÖZEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 123
Özet
Çok yönlü kimyasal sensör olan G proteinine kenetli reseptörler hücre büyümesi ve sinirsel iletim gibi fizyolojik açıdan önemli biyolojik olaylarda öne çıkan görevlere sahiptir. Bu nedenle; kalp krizi, sinir hastalıkları ve yüksek tansiyon gibi rahatsızlıklara karşı kullanılan ilaçların %50si GPKRleri hedeflemektedir. GPKRlerin dimer hâlinde bulundukları ve fonksiyonlarını yerine getirdikleri bilinmektedir. Çalışmalar; dimerleşmenin reseptör aktivasyonu, sinyal iletimi, hücre işi taşıma, hücre yüzeyi hareketliliği ve ligand etkileşimleri gibi nedenlerle gerçekleştiğini göstermektedir. Homodimerizasyon ve heterodimerizasyon kanıtları bir hayli olsa da GPKRlerin neden oligomer oluşturduğu üzerinde fikir birliği bulunmamaktadır. Ancak, oligomerleşme gerçekleştiğinde reseptörlerin farmakolojik özellikleri değişebildiğinden olayın lokalizasyonu ve nedeni dikkat çeken konulardandır. Bir protein yahut biyolojik olayın lokalizasyonu üzerine elde edilen kapsamlı bilgi protein ya da olayın işlevinin çözülmesini sağlamaktadır. Ste2, Ste3p ve Gpr1p maya GPKRleri in vivo GPKR çalışmaları için model olarak kullanılmaktadır. Ste2p?nin homodimer oluşturduğu bilindiğinden de reseptör yıllardır dimerleşme çalışmalarının odağındadır. Hücre içi fraksiyonlanma çalışmaları Ste2p alfa faktör reseptörü dimerlerinin hücre zarında bulunduğu kadar endoplazmik retikulumda da görüldüğünü önermiş olsa da laboratuvarımızda yapılan yakın bir çalışma, bölünmüş EGFP ile işaretlenen Ste2p dimerlerinin endoplazmik retikulumda sinyal vermediğine işaret etmektedir. Bu nedenle, bu çalışmada proteinlerin hücre zarına taşınırken geçtiği organelleri işaretleyen floresan organel işaretleyici proteinlerin hazırlanması amaçlanmıştır. Böylece, bu işaretleyicilerin bölünmüş EGFP ile etiketlenmiş Ste2 dimerleri ile kolokalizasyonu canlı hücrelerde noninvaziv bir yöntemle dimerleşmenin nerede gerçekleştiğini gösterebilecektir. Bu amaç doğrultusunda, kısa hedefleyici sekanslar kullanılarak kırmızı endoplazmik retikulum işaretleyicileri yapılmıştır. Geç endozom, Golgi ve COPII vezikül işaretleyicileri ise yerleşik proteinlerin C uçlarından mCherry kırmızı floresan proteini ile işaretlenmesi ile oluşturulmuştur. Ayrıca, peroksizom integral zar proteini kullanılarak peroksizom işaretleyicisi de bu çalışmada hazırlanmıştır. Görüntülenen hücre içi bölgeler daha önceki tanımlara uygun karakteristik morfoloji göstermişlerdir. Organel işaretleyicilerin işlevini değerlendirmek için EGFP ile etiketli Ste2 ve Gpr1 reseptörleri ile kolokalizasyonları gerçekleştirilmiş ve hücre zarı proteinlerinin taşınması ile ilgili bilinenlerle tutarlı sonuçlar elde edilmiştir. Dolayısıyla, bu işaretleyicilerin canlı maya hücrelerinde kolokalizasyon çalışmaları için değerli kaynakları olduğu güvenle söylenebilir. Ayrıca bu işaretleyiciler; pahalı antikorlar ya da zararlı kimyasallar kullanılmadan canlı hücrelerde organel işaretlenmesi, karakterize edilmemiş proteinlerin lokalizasyonu dolayısıyla da işlev tayini ve organellerin dağılım ve dinamiklerinin incelenmesi için kullanılabilir.
Özet (Çeviri)
G-protein-coupled receptors, which are the most versatile chemical sensors, have prominent role in physiologically important cellular processes including cell growth and neurotransmission. Therefore, they are targeted by almost 50% of drugs in the market against diseases such as heart failure, neurological disorders and hypertension. It is well established phenomenon that GPCRs exist and function as dimers. Studies illustrate that dimerization may be favored for receptor activation, signal transduction, trafficking, cell surface mobility and ligand interactions. Even though evidences of homo- and hetero-dimerization accumulated there is no consensus on why GPCRs oligomerize. Since the pharmacological characteristics of the receptors may be altered when oligomerization occurs, the localization and reason of the phenomenon draws great attention. Comprehensive knowledge of the localization of a protein or biological process unravels the function of the protein or process. Yeast GPCRs, Ste2p, Ste3p and Gpr1p, serve as models for GPCR studies in vivo. Since Ste2p is known to form homodimer, dimerization studies have been focused on the receptor for years. Although subcellular fractionation data indicate that Ste2p dimers are found in the ER as many as in the plasma membrane, recent study conducted in our lab points out that the Ste2 dimer does not fluorescence in the ER when labeled with split EGFP. Hence, the aim of the study was to generate fluorescent organelle marker proteins which label the subcellular compartments on the trafficking route of membrane proteins. By co-localizing the markers with split EGFP tagged Ste2 dimer, where the dimerization occurs in living cells through a noninvasive approach could be identified. Therefore, using short targeting sequences, red ER marker fluorescent protein was constructed in the study. Using resident proteins of the late endosome, the Golgi apparatus and COPII vesicle, related full-length organelle marker proteins were prepared by tagging them at carboxy terminal with mCherry, a red FP. Furthermore, to be used for further studies in our lab, peroxisome markers using resident peroxisome protein were also generated. The visualized subcellular compartments showed characteristic morphologies consistent with previous descriptions. In order to assess the functionality of the organelle markers, they were co-localized with EGFP tagged Ste2p and Gpr1p. All the results were consistent with expectation based on knowledge on membrane protein trafficking. Therefore, it can be confidently suggest that all the markers are valuable resources for co-localization studies in live yeast cells. Moreover, they can serve for organelle marking in live cells without using expensive antibodies or harmful chemicals, identification of localization and thus function of unidentified proteins and monitoring the distribution and dynamics of organelles.
Benzer Tezler
- Bir çorap örme makinasının ana elemanlarının tasarımı ve imalatının incelenmeai
An Invest on design and manufacturing of some components of a sack knitting machine
SENAİ YALÇINKAYA
Doktora
Türkçe
1998
Eğitim ve ÖğretimMarmara ÜniversitesiMakine Eğitimi Ana Bilim Dalı
PROF.DR. OSMAN YAZICIOĞLU
- Dağıtım merkezi depolarına ilişkin hiyerarşik depo tasarım metodolojisi ve konvansiyonel/otomatik depo karar problemine ilişkin analitik bir model
Hierarchical warehouse design methodology and an analytical model for conventional/automatic warehouse decision problem for distribution centers
İSMAİL KARAKIŞ
Doktora
Türkçe
2014
Endüstri ve Endüstri Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiEndüstri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MURAT BASKAK
- Makine öğrenimi etkileştirilmiş ekstrüzyon bazlı 3 boyutlu yazıcıların optimizasyonu
Machine learning-enabled optimization of extrusion-based 3d printing
SAJJAD RAHMANI DABBAGH
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Makine MühendisliğiKoç ÜniversitesiTasarım, Teknoloji ve Toplum Bilimi Ana Bilim Dalı
Assoc. Prof. Dr. SAVAŞ TAŞOĞLU
- Buzdolabı kompresörlerinde krank yataklarının optimizasyonu ve rulmanlı yatak kullanımının incelenmesi
Optimization of the crankshaft bearings and investigation of the ball bearing usage in the compressor of the refrigerator
OSMAN BODUR
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
EnerjiYıldız Teknik ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖZGEN ÜMİT ÇOLAK
- Gerçek görüntüden elde edilen koordinatlarla robot kol hareket optimizasyonu
Optimization of the route for a robot arm by captured coordinate from a real image
MURAT KERT
Yüksek Lisans
Türkçe
2006
Elektrik ve Elektronik MühendisliğiMustafa Kemal ÜniversitesiElektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ERSİN ÖZDEMİR