Saturation mutagenesis of Toluene/o-Xylene Monooxygenase at alpha subunit residues F176, F196 and Q204 for the regiospecific hydroxylation of aromatics
Toluen/o-Ksilen Monooksijenazın alfa altbirim F176, F196 ve Q204 pozisyonlarının aromatiklerin hidroksilasyonu için saturasyon mutagenezi
- Tez No: 342757
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. GÖNÜL SCHARA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Fatih Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 94
Özet
Toluen/o-ksilen monooksijenaz (ToMO) (EC: 1.14.13), sübstitue benzenleri de içeren geniş bir substrat yelpazesine sahip, çok-komponentli, hem-içermeyen, çift demirli bir enzimdir. Bu enzim, organik kirleticilerin biyoremediasyonu ve endüstriyel açıdan değerli olan kimyasalların sentezi için katalitik potansiyellere sahiptir. Bu çalışmada, ToMO hidroksilaz komponentinin F176, F196 ve Q204 pozisyonlarına katalitik aktivite ve regiospesifiklik üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla bölge saturasyon mutagenezi uygulandı. Bölge saturasyon mutagenezi ?overlap-extension PCR? yöntemiyle gerçekleştirildi ve mutantlar hızlı bir agar-plak yöntemi ile tarandı. Elde edilen mutantlar ile fenol, toluen ve naftalin üzerinde tüm-hücre biyodönüşüm deneyleri yapıldı. Ürünler, yüksek basınç sıvı kromatografisi ile analiz edildi. Bu çalışma sonucunda, TouA F176 pozisyonu için iki yeni regiospesifik mutant (F176N ve F176H) elde edildi. TouA F176N mutantı, fenolden % 77 hidrokinon ve toluenden % 92 p-kresol elde ederek en regiospesifik mutant olarak tespit edildi. TouA F176H mutantı test edilen substratlar için aktivite artışı gösterdi. Örneğin, TouA F176H fenolden hidroksifenolleri yapan-tip ToMO'ya kıyasla 5 kat daha hızlı üretti (5.84 ve 1.17 nmol / dk ? mg protein). Ayrıca, TouA F196 ve Q204 mutantlarından bazılarında küçük regiospesifik değişiklikler bulundu. Örneğin, wild-type enzime kıyaslandığında, TouA F196I mutantının, toluenden iki kat daha az o-kresol ve % 19 daha fazla p-kresol ürettiği, TouA Q204A mutantının ise naftalinden % 6 daha fazla 1-naftol ürettiği tespit edildi.
Özet (Çeviri)
Toluene/o-xylene monooxygenase (ToMO) (EC: 1.14.13) is a multicomponent non-heme diiron enzyme with a broad substrate range of aromatics, including substituted benzenes. It has catalytic potentials for bioremediation of organic pollutants and synthesis of industrially valuable chemicals. In this study F176, F196 and Q204 positions of ToMO hydroxylase component (TouA) were subjected to site-saturation mutagenesis to investigate their roles in catalytic activity and oxidation regiospecificity. Site-saturation mutagenesis was achieved by overlap-extension PCR method and the mutants were screened using a rapid agar-plate assay. The isolated mutants were assayed by whole-cell biotransformation of phenol, toluene and naphthalene. Products were analyzed via high-pressure liquid chromatography. This study yielded two new regiospecific mutants of TouA F176 (F176N and F176H). TouA F176N variant was the most regiospecific mutant for hydroquinone formation (77%) from phenol and p-cresol formation (92%) from toluene. TouA F176H variant was also found to be an improved mutant for the tested substrates. For example, TouA F176H produces hydroxyphenol(s) 5-fold faster than wild-type ToMO (5.84 and 1.17 nmol/min ? mg protein) from phenol. In addition, slight changes in regiospecificity were found among variants of TouA F196 and Q204. For example, TouA F196I variant produced 2-fold less o-cresol and 19% more p-cresol from toluene, and TouA Q204A variant produced 6% more 1-naphthol from naphthalene compared to wild-type ToMO.
Benzer Tezler
- Role of alpha-subunit position leucine 95 of Pseudomonas sp. OX1 toluene/o-xylene monooxygenase on catalysis
Pseudomonas sp. OX1 toluene/o-xylene monooksijenaz in alfa altbirim pozisyonlarından lösin 95'in katalizdeki rolü
CANSU KURT
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
BiyomühendislikFatih ÜniversitesiGenetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. GÖNÜL SCHARA
- Protein engineering of toluene monooxygenases for biotechnology applications
Toluene monooksijenaz enzimlerinin biyoteknoloji alanlarında kullanılmaları için protein mühendisliği teknikleri uygulanması
KÜBRA CANSU YILDIRIM
Doktora
İngilizce
2017
Biyomühendislikİstanbul ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
- Site-saturation mutagenesis of crucial residues in NAD+/NADP+ specificity of formate dehydrogenase from candida methylica
Candida methylica format dehidrogenaz?ın NAD+/NADP+ spesifitesi için kritik bölgelerin bölge saturasyon mutagenezi
GÜLŞAH PAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2009
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Gossypium hirsutum format dehidrogenaz enzimi üzerine bölge doygunluk mutasyonu uygulamaları
Site saturation mutagenesis applications on Gossypium hirsutum formate dehydrogenase enzyme
KÜBRA ATİK
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
- Generation of mutant libraries for directed evolution of a thermophilic P450 enzyme
Termofilik bir P450 enzimin yönlendirilmiş evrimi için mutant kütüphanelerinin oluşturulması
EMRE HAKLI
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ NUR BAŞAK SÜRMELİ
PROF. DR. ERDAL BEDİR