Generation of mutant libraries for directed evolution of a thermophilic P450 enzyme
Termofilik bir P450 enzimin yönlendirilmiş evrimi için mutant kütüphanelerinin oluşturulması
- Tez No: 622740
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ NUR BAŞAK SÜRMELİ, PROF. DR. ERDAL BEDİR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 62
Özet
Doğal seçilimden ilham alan yönlendirilmiş evrim, protein mühendisliğinde enzimler tasarlanırken sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Laboratuvar ortamında rastgele mutasyon uygulanarak, mevcut proteinlerin istenen karakterleri taşıyan proteinlere yinelemeli olarak evrilmelerine olanak tanımaktadır. Bununla birlikte, kütüphane oluşturulması, yönlendirilmiş evrimin en temel parçalarından biridir. Farklı inşa metodlarının kullanılması hem oluşturulan varyantların sayısını ve çeşitliliğini hem de kullanılan tarama/seçme tekniklerini etkilemektedir. İlk çıkan prosedürlerden olan hata meyilli PZR, mutasyon yapıcı suşlar, kimyasal mutajenler ve DNA karıştırma tüm genin mutasyonunda başarılı olsa da büyük kütüphaneler oluşturmalarından dolayı daha fazla tarama/seçme zahmeti gerektirdi. Diğer taraftan dejenere primerlerin kullanımı ve bölge doyurma mutasyonu gibi yeni yaklaşımlar, polipeptit zincirinde, belirli bölgelerde bulunan amino asitlerin rastgele mutasyonuna olanak tanıyarak tarama/seçme eforunu azalttı. Özellikle, biyokatalizörlerin aktif bölgeleri hedef olarak seçildi ve katalitik verimlilikleri arttırıldı. Sulfolobus Acidocaldarius'dan gelen, bir P450 protein ailesi üyesi olan CYP119, peroksidasyon, monooksidasyon ve oksidoredüksiyon tepkimelerini gerçekleştirebilen termostabil bir enzimdir. Burada, 213. ve 214. amino asit pozisyonlarında, kombinatoryal aktif bölge doygunluk testi uygulanarak CYP119 varyantlarından oluşan bir mutant kütüphanesi yaratılmış ve hidrojen peroksiti oksidan olarak kullanırken arttırılmış peroksidaz aktivitesi için florasan temelli, etkili bir tarama yöntemi geliştirilmiştir. Mutant kütüphanenin taranması sonucu, Thr213Arg – Thr214Ile mutasyonlarını taşıyan varyantın doğal CYP119 ile karşılaştırıldığında 1.32 kat daha fazla peroksidaz aktivitesi gösterdiği tespit edilmiştir.
Özet (Çeviri)
Directed evolution, inspires from natural selection, is a frequently utilized approach in protein engineering for designing enzymes. It allows iterative evolution of existing proteins towards the ones with desired characteristics by the application of random mutagenesis in the laboratory. However, library construction constitutes the most fundamental part of directed evolution. Application of different construction methods affects both the number and diversity of variants created and the screening/selection techniques used. Early procedures including error-prone PCR, mutator strains, chemical mutagens and gene shuffling have been successful in whole gene mutagenesis yet have been required more screening/selection effort by leading larger libraries. On the other hand, recent approaches such as use of degenerate primers and site saturation mutagenesis have decreased the screening/selection effort by allowing random mutagenesis of amino acids located at specific positions in the polypeptide chain. Especially, active site residues of biocatalysts were chosen as targets and the catalytic efficiencies were enhanced. CYP119, a member of cytochrome P450 protein family, from Sulfolobus Acidocaldarius is a thermostable enzyme capable of catalyzing peroxidation, monooxygenation and oxidoreduction reactions. Here, a library of mutants consist of CYP119 variants was created via application of combinatorial active site saturation test (CAST) in amino acid positions 213 – 214 and an effective fluorescence-based method was developed to screen the library for increased peroxidase activity while utilizing hydrogen peroxide as oxidant. After screening of mutant library, a variant with Thr213Arg – Thr214Ile substitutions showed 1.32-fold increased peroxidase activity in the catalysis of Amplex Red compared to wild type CYP119.
Benzer Tezler
- Generation of novel random mutagenesis lipase libraries via directed evolution
Yönlendirilmis¸ evrim metodu ile yeni, rastgele mutasyona uğratılmış lipaz kütüphanelerinin oluşturulması
BATUHAN ORBAY YENİLMEZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
BiyomühendislikSabancı ÜniversitesiBiyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. OSMAN UĞUR SEZERMAN
- Protein engineering applications on industrially important enzymes
Endüstriyel öneme sahip enzimlerin protein mühendisliği uygulamaları
GÜLŞAH ÖZGÜN
Doktora
İngilizce
2019
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Konukçu-patojen ilişkilerinin dayanıklılık genleri yönünden incelenmesi
Investigation of resistance genes on host-pathogen interactions
CAHİT ÇAKIR
- Yazlık iki sıralı arpa (Hordeum vulgare L.)'da mutant çeşit adaylarının belirlenmesi
Idendification of mutant cultivar candidates in spring two-row barley cultivar (Hordeum vulgare L.)
MEHMET KERİM GÜLLAP
- Diabetes insipidus'lu hastaların AQP2 geninde tanımlanan mutasyonların fonksiyonel analizleri
Functional analysis of mutations found in AQP2 gene of patients with diabetes insipidus
TUĞÇE KARADUMAN
