Geri Dön

Evolutionary engineering of phenylethanol-resistant saccharomyces cerevisiae

Evrimsel mühendislik yöntemi ile feniletanole dirençli saccharomyces cerevisiae suşlarının eldesi

PDF İndir

  1. Tez No: 350410
  2. Yazar: CAN HOLYAVKİN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Biology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2013
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 135

Özet

Saccharomyces cerevisiae, genetik ve moleküler biyoloji çalışmalarında çok sık kullanılan, özellikleri iyi bilinen model organizmalardan biri sayılmaktadır. Bilimsel çalışmalardaki kullanım alanlarının yanı sıra, S. cerevisiae endüstriyel üretimde önemli bir yere sahiptir. Özellikle içki üretiminde birincil etanol üretici durumundadır. Aynı zamanda ekmek yapımında da kullanılmaktadır.S. cerevisiae, tek hücreli bir ökaryotik mikrorganizma olup, tomurcuklanma yolu ile hem eşeysiz, hem de mayoz bölünme gerçekleştirerek eşeyli olarak çoğalabilmektedir. S. cerevisiae'nin yüksek ökaryotların genomu ile gösterdiği yüksek homoloji de bir çok bilimsel çalışmada yarar sağlamaktadır. Özellikle insan genomu ile olan benzerliği sebebiyle, kanser, yaşlanma ve birçok hastalık mekanizmaları S. cerevisiae hücreleri kullanılarak araştırılmaktadır.Mikroorganizmalar, doğal ve endüstriyel koşullarda sürekli olarak stres altında bulunmaktadır. Bu stresler kendini, sıcaklık, osmolarite, oksidatif stres, mekanik stress ve metal stresi olarak gösterebilir. Bu stres yollarının araştırılması için S. cerevisiae oldukça iyi bir örnek olarak sayılmaktadır. Bilim insanlarının bu konuda gerçekleştirdiği çalışmalar, bu organizmaların çeşitli streslere karşı dirençlerinin nasıl arttırılabileceği üzerinde yoğunlaşmaktadır. Aynı zamanda, endüstriyel verimin arttırılması amacıyla, üreticilerin de dirençlerin geliştirilmesine karşı önemli bir ilgisi bulunmaktadır.Bu tez çalışmasında, feniletanol adlı bir alkol türevinin maya hücreleri üzerindeki etkisinin incelenmesi ve maya hücreleri üzerinde feniletanole karşı geliştirilen direnç mekanizmalarının analiz edilmesi amaçlandı. Bunun için ilk olarak evrimsel mühendislik yöntemi ile feniletanole dirençli S. cerevisiae mutantları elde edildi. Ardından, feniletanole dirençli S. cerevisiae mutantlarında, feniletanol direncinin moleküler mekanizmasını anlamak amacıyla fenotip, genotip ve fizyolojik analizler gerçekleştirildi.Çalışma başlangıcında evrimsel mühendislik yaklaşımı yaban tip S. cerevisiae hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Bu amaçla ilk olarak başlangıç popülasyonunda genetik çeşitliliği arttırmak için kimyasal bir mutajen olan etil metan sülfonat (EMS) yaban tip maya hücrelerine uygulandı. Elde edilen mutajenize edilmiş karışık maya kültürü, sonrasında yapay seçilime maruz bırakılarak, karışık kültür içinden istenen fenotipteki bireylerin seçilmesi planlandı. Yapay seçilim süresince, ilk başta düşük miktarda (1.5 mL/L) feniletanol karşışık kültüre uygulandı ve inkübasyon gerçekleştirildi. Sonraki basamakta, hayatta kalan maya hücreleri, daha yüksek bir feniletanol konsantrasyonunda tekrar inkübe edildi. Her basamakta, OD600 değerleri ölçüldü ve hayatta kalma oranları kritik bir seviyeye düşene kadar bu seçilim işlemleri devam edildi. En son 3.6 mL/L feniletanol konsantrasyonuna kadar gelindi ve 56. nesilde yapay seçilim işlemi durduruldu. Bu elde edilen son popülasyondan rastgele 10 birey seçildi ve direnç yeteneklerine göre kıyaslandi. On mutant birey, yaban tip ve son popülasyonun feniletanol dirençleri damlatma ve MPN yöntemleri ile ölçüldi ve karşılaştırıldı. Elde edilen 10 birey arasından en yüksek direnci gösteren birey seçilmiş ve ?C9? olarak adlandırıldı. Elde edilen birey üzerinde, genetik kararlılık testi uygulandı. Bu test ile dirençli maya mutantının direncinin kalıcılığı ölçülmesi amaçlandı. Damlatma ve MPN çalışmaları, bu bireyin feniletanol direncinin değişmediğini gösterildi. İlgili mutantlarda feniletanol direnci genetik olarak kararlı bulundu.Feniletanol dirençli maya mutantının çapraz direnç özellikleri de incelendi. Bunun için çapraz direnç testi uygulandı. Bu testte, seçilen mutant ve yaban tip, farklı konsantrasyonlarda feniletanol (2.5 mL/L ve 3 mL/L), etanol (8%, 10% ve 12% v/v), asetat (0.004% v/v), kobalt (1 mM ve 3 mM), bor (80 mM), bakır (0.5 mM), hidrojen peroksit (0.5 mM) ve nikel'e (0.2 mM) maruz bırakıldı, hayatta kalma oranları kıyaslandı. Tüm bu stres faktörleri açısından, feniletanol dirençli mutant, etanole karşı da direnç gösterdi. Etanol ve feniletanol'ün hücresel etki mekanizmaları birbiri ile yakın olmasından dolayı benzer hücresel cevaplara neden olması beklenen bir durumdur. Feniletanol dirençli C9 mutantı, aynı zamanda kobalt'a karşı gözle görülebilir bir hassasiyet göstermektedir. Microarray verilerinden elde edilen bilgiler ışığında, bu durumun azalan demir regülasyonu ile ilgili olduğu düşünülebilir.Feniletanol dirençli mutantın sahip olduğu bu direncin incelenmesi için transkriptomik analiz gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, DNA mikroarray yaklaşımı kullanılmış ve C9 ile yaban tip arasında, kontrol koşullarındaki transkripsiyon profilleri karşılaştırılmıştır. Analiz sonucunda, C9'un genel transkripsiyon profilinde ilgi çekici sonuçlara rastlanmıştır. Bu sonuçlardan biri, çok yüksek sayıda gende transkripsiyon artışı görülmesidir. S. cerevisiae genomunda bulunun yaklaşık 6000 gen içerisinde 1000 kadar genin anlatımı artarken 800'e yakın gende de anlatımda azalış olmuştur. Tüm bu genler, maya genomunun yaklaşık %30'una denk gelmektedir. Bu yüksek transkripsiyon profili, maya hücrelerinin stres anında gösterdiği kısa süreli cevaplar ile benzerlik göstermektedir. Normalde kısa süren ve çok sayıda kendini gösteren bu reaksiyonlar çevresel stres cevabı (Environmental stress response, `ESR') olarak bilinmektedir. Feniletanol dirençli mutant'ta ciddi oranda ESR'de sorumlu genler aktif durumundadır.Feniletanol dirençli mutanta ait transkripsiyon profilinde ilk göze çarpan upregüle olan 1000 kadar gen arasında, karbonhidrat metabolizmasının önemli bir yer kaplamasıdır. Anlatımı artan 166 gen ile karbonhidrat metabolizmasından sorumlu genler, C9'un tüm upregüle genlerinin yaklaşık %20'sini oluşturmaktadır. Bunu 98 gen ile oksidatif stres cevabı izlemektedir. Aynı zamanda upregüle genler arasında 63 tanesi genel stres cevabından, 35 tanesi hücre duvarı organizasyonundan, 21 gen ise otofaji ve mitokondri yıkımından sorumludur. %20'lik katkısı ile, karbonhidrat metabolizması, C9 mutantında önemli bir şekilde tetiklenmiştir. Benzer durum, daha önce tanımlanan ESR durumunda da görülmüştür. Hücreler, stres altında kısa süreliğine glikoz metabolizmasını hızlandırmaktadır. Ancak, C9 mutantında bu genlerin anlatımları durmadan ve aralıksız gerçekleştirilmiştir.Benzer durum, anlatımı azalan genlerde de görülmüştür. Analiz sonuçlarına göre, C9 bireyinde özellikle nükleik asit metabolizması ve protein, ribozom sentezinde görev alan çoğu genin anlatımı ciddi oranda azalmıştır. Anlatımı azalan 821 genin %81'i rRNA ve tRNA'ların sentezi ve bağlanmasında, translasyonun başlamasında, RNA- DNA bağlanmasında, helikaz aktivitesinde görev almaktadır. C9'da protein sentezini azaltacak yönde görülen bu değişiklikler aynı zamanda genel ESR durumunda da görülmektedir. Bu sonuçlar da feniletanol dirençli C9 bireylerinin sürekli bir ESR durumunda olduğunu göstermektedir.C9'un aynı zamanda, özelleşmiş stres cevapları da verdiği görülmüştür. Yaban tipe kıyasla, aldehit dehidrogenaz 3 adlı gen 234 kat fazla anlatımı olmuştur. Alkolün yıkılması sırasında ortaya çıkan bir toksik madde olan aldehidin yıkılmasından sorumlu bu genin yüksek şekilde anlatılması, C9'un sahip olduğu feniletanol direncinde bir yere sahip olabilir.Bu tez çalışmasında, feniletanol dirençli S. cerevisiae hücreleri evrimsel mühendislik yöntemleri ile elde edilmiş ve transkripsiyon seviyesinde karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Dirençli maya mutantının yüksek seviyede gösterdiği gen anlatımı, yaban tip hücrelerin stres anında verdiği anlık tepkilerle benzerlik göstermektedir. Anlatımın yüksek ve karmaşık olması, feniletanol direncinin tek bir gene veya gen grubuna atanmasını zorlaştırmaktadır. Bu sebeple, çevresel stres cevaplarının daha iyi anlaşılması ve feniletanol direncinin temel kökeninin bulunması için yeni çalışmalara gerek duyulmaktadır.

Özet (Çeviri)

Saccharomyces cerevisiae is one the most widely used model organisms in genetics, molecular biology and metabolic studies. Additional to its use in scientific area, it is one of the oldest microorganisms used for ages for industrial applications. S. cerevisiae is a unicellular eukaryotic organism, which can be found in haploid and diploid form, and can induce meiosis to generate new progeny of haploid from diploids (so called sporulation event) or reproduce asexually by budding. It shares high degree of homologies with higher eukaryotes like human. Due to these functional similarities, S. cerevisiae can be used in research human-related subjects such as cancer, aging and other human diseases.In natural environment and in industrial usage, S. cerevisiae cells are always under stress of environmental changes. These changes can be seen as osmotic, temperature, dehydration, starvation, metal ions etc. Researchers are interested in the principles of how microorganisms resist with all these types of stresses. Additionally, they are searching for the answers how stress tolerance could be increased. Producers are also interested in increasing in yield and for this reason; they are searching for stress- resistant microorganisms.The aim of the present study is obtaining phenylethanol-resistant yeast strain via evolutionary engineering approach and perform transcriptomic and metabolic characterization to identify responsible pathways in this resistance.In this thesis study, firstly, phenylethanol-resistant S. cerevisiae mutants were obtained by evolutionary engineering approach. Phenotypic and genetic characterization was then carried out to identify the molecular principles of phenylethanol resistance in S. cerevisiae.To apply evolutionary engineering to wild type S. cerevisiae cells, these cells were treated with a chemical mutagen EMS (Ethyl Methane Sulfonate) to increase genetic variances in the initial population to which selection would be applied. This mutagenized culture was cultivated at increasing phenylethanol concentrations in the culture medium along with the wild type to determine the initial stress level to be applied. Phenylethanol stress was then applied to this mutagenized culture. The phenylethanol concentration was increased gradually for each successive population. The first population was obtained upon 1.5 mL/L exposure and the final 56th population was applied to 3.6 mL/L PEA. The final population was used for selecting ten individual mutants. Those ten individual mutants, wild type and the final population were tested for phenylethanol resistance and it was observed that the evolved strain and the final population could grow at high phenylethanol concentrations at which the wild type could not show any sign of survival. One of the individual mutants which show highest phenylethanol-resistance was chosen and genetic stability assay was applied. It was shown that the phenylethanol-resistance phenotype was a genetically stable trait in the mutant tested. This evolved strain was termed C9.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    874307

    Omic analyses of stress-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Strese dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin omik analizleri

    ENES FAHRİ TEZCAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

    PROF. DR. ŞEFİKA KUTLU ÜLGEN

  2. Tez No

    874312

    Molecular characterization of phenylethanol resistance in Saccharomyces cerevisiae

    Feniletanol direncinin Saccharomyces cerevısıae'de moleküler karakterizasyonu

    CAN HOLYAVKİN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    418982

    Inverse metabolic engineering of aluminium-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Tersine metabolik mühendislik yöntemi ile aluminyuma dirençli Saccharomyces cerevisiae eldesi

    NACİYE DURMUŞ İŞLEYEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    547652

    Inverse metabolic engineering and molecular characterization of resistance to phenolic compounds in Saccharomyces cerevisiae

    Saccharomyces cerevisiae'de fenolik bileşiklere direncin tersine metabolik mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu

    BURCU HACISALİHOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  5. Tez No

    770931

    Evolutionary engineering of rapamycin-resistant yeast

    Evrimsel mühendislikle rapamisine dirençli maya eldesi

    ÖMER ESEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

Geri Dön