Geri Dön

Molecular characterization of phenylethanol resistance in Saccharomyces cerevisiae

Feniletanol direncinin Saccharomyces cerevısıae'de moleküler karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 874312
  2. Yazar: CAN HOLYAVKİN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 100

Özet

Alkol üretim endüstrisi, düşük maliyetle yüksek konsantrasyonlu alkol üretme zorluğuyla karşı karşıyadır. Alkol üretiminde kullanılan ana organizma olan maya, sınırlı alkol direncine sahiptir ve birçok endüstriyel suş, %13 etanolün üzerindeki konsantrasyonlarda verimli bir şekilde fermentasyon gerçekleştiremez. Mayanın alkol direncini artırmak, genel verimliliği artırabilir ve damıtma maliyetlerini azaltabilir. Bununla birlikte, alkolün hücresel yapılar ve yolaklar üzerindeki çeşitli zararlı etkileri, rasyonel tasarım yoluyla dirençli suşların elde edilmesini zorlaştırmaktadır. Bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik, alkole dirençli suşlar elde etmenin bu tür zorluklarının üstesinden gelmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, bir organizmanın gen havuzunu in vitro olarak mutajenik maddelerle çeşitlendirerek ve seçici ortam oluşturmak için yapay stres uygulayıp, istenen fenotipe sahip adapte olmuş organizmalar ile sonuçlanarak doğal evrimi taklit eder. Bu yaklaşım, farklı türde alkollere ve ağır metallere dirençli mayalar da dahil olmak üzere çeşitli dirençli maya suşlarını başarıyla üretmiştir. Pek çok bitki esansiyel yağında bulunan yaygın bir aromatik alkol olan feniletanol (2-PE), yapısal olarak etanole benzer ve direnç gelişimi açısından ilgi çekicidir. Mevcut 2-PE üretimi, insan sağlığı için toksik olan ham maddelerin kullanıldığı kimyasal senteze dayanmaktadır. Alternatif bir üretim yöntemi, zararlı maddelerin kullanımını azaltabilir. Bununla birlikte, 2-PE'nin olumsuz etkileri ve metabolik yolakları ile ilgili araştırmalar sınırlıdır. Bir önceki çalışmada, evrimsel mühendislik yaklaşımı kullanılarak 2-PE stres direncinde üç kat artışa sahip bir maya suşu elde edilmiştir. Ayrıca, bu dirençli maya suşunda 2-PE direncinin moleküler mekanizmaları, tüm genom transkriptomik analizi yoluyla araştırılmıştır. Bununla birlikte, bu direncin altında yatan genomik nedenlerin bilinmemesi, genomik düzeyde daha fazla analiz yapılmasını gerektirmiştir. Bu doktora tez çalışmasının amacı, 2-PE stresine dirençli suş üzerinde genomik analizler yapmak ve bu verileri transkriptomik ve metabolik analizlerle birleştirerek altta yatan moleküler mekanizmaları tanımlamaktır. Bu çalışmanın diğer bir amacı, akademik ve endüstriyel maya araştırmaları için kullanılmak üzere 2-PE stresine dirençli S. cerevisiae suşunun yüksek kalitede bir araya getirilmiş ve anote edilmiş bir referans genomunu oluşturmaktır. Bu, yüksek kapsamlı dizileme, de novo genom birleştirme işlemlerini içermektedir. Bu çalışmanın diğer bir amacı, çeşitli stres koşullarına karşı çapraz direncin değerlendirilmesi, kontrol ve stres koşulları altında büyüme ve metabolit profillerinin analiz edilmesi dahil olmak üzere bir dizi deney yoluyla 2-PE stresine dirençli mutant suşun fizyolojik özelliklerinin daha kapsamlı bir karakterizasyonunu gerçekleştirmektir. Ayrıca, dirençli suşun direnç mekanizmaları ve potansiyel uygulamaları hakkında daha kapsamlı bilgi edinebilmek için hücre duvarı özelliklerinin karşılaştırılması da hedeflenmiştir. Çalışma kapsamında gerçekleştirilen gelişme analizine göre, 2-PE stresine dirençli S. cerevisiae C9 suşu, 2-PE stresi altında referans suşa kıyasla daha yüksek bir gelişme hızı sergilerken, referans suş, stres olmadığında daha yüksek bir maksimum spesifik gelişme hızı göstermiştir. Çapraz direnç analizi, C9'un 48 saatlik inkübasyonda, özellikle 0.5M ve 0.75M konsantrasyonlarda NaCl'ye karşı artan hassasiyet gösterdiğini göstermiştir. Testlere göre 1M ve 2M sorbitol stresine karşı referans suş ile C9 arasında önemli bir fark gözlenmemiştir. Bir sitoplazmik aldehit dehidrojenazı kodlayan gen olan ALD3 ile mitokondriyel sitoplazmik aldehit dehidrojenazı kodlayan gen olan ALD4 genlerinin dirençli suşta yüksek ekspresyon gösterdiği bilinmektedir.. Her iki suşun fenilasetaldehit duyarlılıkları benzer düzeydedir. Ancak C9 suşu fenilasetata anlamlı düzeyde çağraz direnç göstermiştir. Buna göre C9'da bu dehidrogeneaz enzimleri aracılığıyla 2-PE'yi fenilasetata dönüştürmeyi içeren bir direnç mekanizması gelişmiş olabilir. Metabolitlerin HPLC analizi, stressiz ve 3 g/L 2-PE stres koşulları altında glikoz tüketimi ve etanol üretiminde C9 ve referans suş arasındaki benzerlikleri ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte, C9 suşu her iki koşulda da referans suştan altı kata kadar daha yüksek asetat ve gliserol üretimi sergilemiştir. C9 suşu ayrıca referans suştan üç ila beş kat daha fazla trehaloz içerirken, glikojen içeriğinin büyük ölçüde değişmeden kaldığı tespit edilmiştir. 2-PE adaptasyonuna yanıt olarak hücre duvarı yeniden yapılandırılmasını değerlendirmek için litikaz duyarlılık testleri yapılmıştır. Bu testler C9 suşunun, referans suştan önemli ölçüde daha yüksek litikaz direnci gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu durum, 2-PE adaptasyonu nedeniyle hücre duvarının yeniden yapılandırıldığına işaret etmektedir. Hem referans hem de strese dirençli S. cerevisiae suşlarında tüm genom dizileme çalışması, C9 suşunda özgün 53 mutasyon ortaya çıkarmıştır. Bu mutasyonlardan 32'si ekzonik bölgelerde yer almaktadır. Önemli ölçüde ekspresyonu artmış olan MAPK sinyal yolakları, 53 mutasyondan üçünü barındırmaktadır. Bu mutasyonlardan biri olan Hog1p.F318L, genellikle gliserol biyosentezi ve tutulmasına aracılık etmek için hiperozmotik strese yanıt olarak aktive olan Hoglp enziminin fosforilasyon bölgesinde yer almaktadır. Kitin-β 1,6 glukan çapraz bağlanmasından sorumlu bir trans-glikosidazı kodlayan CRH1 geninde ise bir başka mutasyon tanımlanmıştır. Homoloji modellemesi ile aday genler için referans ve mutant protein yapıları karşılaştırılmış ve mutasyonlar nedeniyle Crh1 ve Hog1 proteinlerinde oluşan önemli konformasyonel ve yapısal değişiklikler ortaya çıkarılmıştır. RPN4, HOG1, CRH1, SSK2, MCA1 ve PDE2 de dahil olmak üzere pek çok mutasyona uğramış genin 2-PE direncine potansiyel olarak katkıda bulunduğu tespit edilmiştir. Bu genlerin direnç mekanizmalarındaki rolleri değerlendirilmiş ve transkripsiyonel aktivasyon, sinyal iletim yolakları, hücre duvarı mimarisi ve ozmotik stres tepkisi gibi olası fonksiyonel etkileri incelenmiştir. 2-PE stresine dirençli S. cerevisiae'nin kapsamlı bir transkriptomik analizi, dirençli suştaki farklılaşan yolakları belirlemek için yapılmıştır. Yolak analizinde dirençli ve referans suşlar arasında önemli anlatım farklılıkları bulunan genler dikkate alınmıştır. Analiz sonuçları, dirençli suşun Çevresel Stres Tepkisi (Environmental Stress Response-ESR) benzeri bir ekspresyon profili sergilediğini göstermiştir. MAPK sinyal yolağının detaylı analizi, C9'da ifade düzeyleri farklılaşan genlerin çoğunlukla hücre duvarının yeniden yapılandırılması, osmolit sentezi, filamentasyon ve eşleşme ile ilişkili olduğunu ortaya çıkarmıştır. Özetle, bu tez çalışmasında, 2-PE stresine dirençli S. cerevisiae üzerinde detaylı moleküler karakterizasyon gerçekleştirilerek, 2-pE direncinin moleküler mekanizmasının aydınlatılması amaçlanmıştır. Transkriptomik analizler, MAPK ve hücre duvarı sinyal yolaklarında anlamlı gen ifade değişimleri olduğunu göstermiştir. Bu yolaklar üzerinde genom dizilemesi sonucunda tespit edilen HOG1 mutasyonunun bu farklılaşmış gen ifade profili ile ilişkili olabileceğine dair bulgular tespit edilmiştir. Gerçekleştirilen metabolit analizlerine dair veriler, artan HOG1 aktivitesi ve ESR-benzeri profil ile uyumludur. Dirençli suşun hücre duvarına yönelik karakterizasyon çalışmaları ve dirençli suşun CRH1 geninde tespit edilen mutasyon, 2-PE direncinin hücre duvarının moleküler yapısındaki değişimden kaynaklanabileceğini göstermektedir. Ayrıca dirençli suşun fenilasetata karşı çapraz direnç geliştirmesi ve ALD3 ile ALD4 gen ifade düzeylerinin artmış olması da, 2-PE direncinin, ifadesi artmış aldehit dehidrogenaz enzimleri aracılığıyla 2-PE'nin fenilasetata dönüştürülmesi ile ilişkili olabileceğini göstermektedir.

Özet (Çeviri)

The alcohol production industry faces the challenge of producing high-concentration alcohol at low cost. Yeast, the main organism used in alcohol production, has limited alcohol tolerance, with many industrial strains unable to efficiently ferment at concentrations above 13% ethanol. Increasing yeast's alcohol tolerance could improve overall efficiency and reduce distillation costs. However, the diverse detrimental effects of alcohol on cellular structures and pathways make it difficult to obtain resistant strains through rational design. Evolutionary engineering, an inverse metabolic engineering approach, can be used to overcome such challenges of obtaining alcohol-resistant strains. This strategy mimics natural evolution by diversifying the gene pool of an organism in vitro with mutagenic agents, and applying artificial stress to create selective pressure, resulting in adapted organisms with the desired phenotype. This approach has successfully produced various resistant yeast strains, including those resistant to different types of alcohols and heavy metals. Phenylethanol (2-PE), a common aromatic alcohol in many plant essential oils, is structurally similar to ethanol and is of interest for resistance development. Current 2- PE production relies on chemical synthesis, which uses raw materials toxic to human health. An alternative production method could reduce the use of harmful materials. However, research on the negative effects of 2-PE and its metabolic pathways is limited. Previously, a Saccharomyces cerevisiae, a yeast strain with a three-fold increase in 2- PE resistance was obtained using evolutionary engineering approach. The molecular mechanisms of 2-PE resistance in an evolved yeast strain were investigated through whole-genome transcriptomic analysis. However, the underlying genomic causes of this resistance remained unknown, necessitating further analysis at the genomic level. The aim of this study was to perform genomic analysis on the 2-PE-resistant strain and combine these data with transcriptomic and metabolic analyses to identify the molecular mechanisms underlying resistance. Another goal of this study was to generate a high-quality assembled and annotated reference genome of the 2-PE-resistant S. cerevisiae strain for use by academic and industrial yeast research communities. This will involve sequencing, de novo assembly and annotation of the resistant strain. Another purpose of this study was to perform a deeper characterization of the physiological properties of the 2-PE-resistant evolved strain through a series of experiments, including assessing cross-resistance to various stress conditions, analyzing growth and metabolite profiles under control and stress conditions, and comparing cell wall characteristics, ultimately to obtain a comprehensive knowledge of the resistance mechanisms and potential applications of the evolved strain. According to growth analysis, the 2-PE-resistant S. cerevisiae strain C9 mutant exhibited a superior growth rate in comparison to the reference strain for 2-PE stress, while the reference strain demonstrated a higher maximum specific growth rate in the absence of stress. The cross-resistance analysis showed that C9 showed increased sensitivity to NaCl at 48-hour incubation, particularly at 0.5M and 0.75M concentrations. There were no significant difference detected between the reference and evolved strains in 1M and 2M sorbitol media. ALD3 and ALD4 a genes encoding cytoplasmic and mitochondrial aldehyde dehydrogenase respectively, were upregulated in the evolved strain. The phenylacetaldehyde sensitivities of both strains did not differ. However, the evolved strain had significantly cross resistance to phenylacetate. The results may suggest a resistance mechanism that includes conversion of 2-phenylethanol to phenylacetate by those dehydrogenases. HPLC analysis of metabolite production revealed similarities between the C9 and the reference strains in glucose consumption and ethanol production under non-stress and 3 g/L 2-PE stress conditions. However, the C9 strain exhibited higher acetate and glycerol production, up to six-fold higher than the reference strain, under both conditions. The C9 strain contained three to five times more trehalose than the reference strain, while glycogen content remained largely unchanged. Lyticase sensitivity assays were conducted to assess cell wall remodeling in response to 2-PE adaptation. The C9 strain demonstrated significantly increased lyticase resistance compared to reference strain, suggesting cell wall remodeling occurred due to 2-PE adaptation. Whole-genome sequencing of the reference and stress-resistant evolved S. cerevisiae strains revealed 53 genomic changes in the C9 strain not present in the reference strain. Among these mutations, 32 were located in exonic regions, indicating that EMS induced mutations without causing lethal damage. Significantly upregulated MAPK signaling pathways harbored three of the 53 mutations. One such change, Hog1p.F318L, was located in the phosphorylation lip of the Hog1p enzyme, which is typically activated in reaction to hyperosmotic stress in order to facilitate glycerol biosynthesis and retention. Another mutation was identified in the CRH1 gene, which encodes a trans-glycosidase involved in the cell wall remodelling via formation of cross-links between chitin and β 1,6 glucan. Homology modeling was used to compared wild type and mutant protein structures for candidate genes, revealing significant conformational and structural changes in Crh1 and Hog1 proteins due to the mutations. The mutations in these proteins may contribute to 2-PE resistance in the mutant strain. Several mutated genes, including RPN4, HOG1, CRH1, SSK2, MCA1, and PDE2, were identified as potentially contributing to 2-PE-resistance. The roles of these genes in resistance mechanisms were explored, revealing various functional impacts such as transcriptional activation, signal transduction pathways, cell wall architecture, and osmotic stress response. A comprehensive genomic analysis of the 2-PE-resistant S. cerevisiae strain was conducted to detect the altered pathways in the evolved strain. Genes with significant expression differences between the evolved and the reference strains were used for pathway analysis. Pathways were extracted from the KEGG database and filtered based on adjusted p-values. The analysis results indicated that the evolved strain displayed an Environmental Stress Response (ESR) like expression profile, and one- sample t-tests were applied to identify the statistical significance of gene set tests. The presence of transcription factors correlated with the pathway enrichment analysis, which highlighted the MAPK signaling pathway, proteasome, autophagy, and ribosome biogenesis. Additionally, KEGG pathway analysis of the MAPK signaling pathway revealed that differentially expressed genes in the evolved strain were primarily associated with cell wall remodeling, osmolyte synthesis, filamentation, and mating. In summary, in this thesis, detailed molecular characterization of 2-PE-resistant S. cerevisiae was carried out to elucidate the molecular mechanisms of 2-PE-resistance. Transcriptomic analyses showed significant expression changes in MAPK and cell wall signaling pathways. The HOG1 mutation detected by genome sequencing may be associated with this expression profile. The metabolite analyses data were also consistent with increased HOG1 activity and an ESR-like transcriptomic profile. In addition, characterization studies performed on the cell wall and the mutation in CRH1 gene indicated that phenylethanol resistance may be related to the alteration in the molecular architecture of the cell wall. The cross-resistance of the evolved strain against phenylacetate and its increased expression of ALD3 and ALD4 genes also suggest that 2-PE-resistance may be associated with conversion of 2-PE to phenylacetate by the overexpressed aldehyde dehydrogeneases.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    350410

    Evolutionary engineering of phenylethanol-resistant saccharomyces cerevisiae

    Evrimsel mühendislik yöntemi ile feniletanole dirençli saccharomyces cerevisiae suşlarının eldesi

    CAN HOLYAVKİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    547652

    Inverse metabolic engineering and molecular characterization of resistance to phenolic compounds in Saccharomyces cerevisiae

    Saccharomyces cerevisiae'de fenolik bileşiklere direncin tersine metabolik mühendisliği ve moleküler karakterizasyonu

    BURCU HACISALİHOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    323731

    Alkil zincirleri ile sübstitüe asimetrik ftalosiyanin sentezi

    Synthesis of alkyl chain substituded unsymmetrical phthalocyanines

    NİLGÜN ÖZGÜR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Kimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ESİN HAMURYUDAN

  4. Tez No

    463785

    Characterization of antioxidant properties of sulfur containing alkyne derivatives

    Yapısında kükürt bulunduran alkin türevlerinin antioksidan özelliklerinin karakterizasyonu

    BAHZAD AHMED KHORSHEED

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyokimyaYüzüncü Yıl Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. METİN KONUŞ

  5. Tez No

    771203

    Rumen bakteri ve funguslarının bazı enzimlerinin moleküler düzeyde karakterisazyonu

    Molecular characterization of some enzymes in rumen bacteria and fungi

    HALİT YÜCEL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiKahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi

    Zootekni Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET SAİT EKİNCİ

Geri Dön