Mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasında çeşitli biyoreaktör performanslarının karşılaştırılması
Comparison of different bioreactor performances for osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells
- Tez No: 355622
- Danışmanlar: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 211
Özet
Sunulan tez çalışmasında, doku iskelesi destekli biyoreaktörlerde mezenkimal kök hücrelerin üreme ve osteojenik farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda kitosan-hidroksiapatit süpergözenekli hidrojeller (kitosan-HA SPHC) ve ipek doku iskeleleri kullanılmış, durgun kültür ile karşılaştırmalı olarak basit karıştırmalı kap biyoreaktör ve perfüzyon biyoreaktörlerde dinamik kültür sistemleri yürütülmüştür. Kitosan-HA SPHC'lerin üretimi mikrodalga ışıma ve gaz köpükleştirme yöntemlerinin birleştirilmesiyle gerçekleştirilmiş; üç boyutlu, gözenekli yapısı Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Bilgisayar Destekli Mikro Tomografi (µCT) analizleriyle görüntülenmiştir. Basit karıştırmalı kap biyoreaktörde 50 rpm karıştırma hızında gerçekleştirilen 28 günlük çalışmada, durgun ve dinamik koşullarda kültüre edilen sıçan adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (rAdMSC'lerin) mitokondriyal aktivitelerinde ve alkalen fosfataz aktivitelerinde önemli bir farklılık tespit edilememiştir. SEM görüntülerinde hücrelerin biyomalzeme yüzeyine tutundukları ve mineralize nodüller oluşturduğu görüntülenmiştir. Bununla birlikte malzeme yüzeyinin tamamen hücreler ile kaplanmadığı dikkat çekmiştir. Perfüzyon biyoreaktörde farklı akış hızında (düşük hız, tek yönlü akış: 0.0476 mL/sa, ve yüksek hız, iki yönlü akış: 6 mL/sa) gerçekleştirilen çalışmalarda ise kemik dokunun daha gerçekçi bir in vitro modelinin oluşturulması amacıyla insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'leri), kemik yıkımından sorumlu osteoklastlara farklılaşan THP-1 hücre hattı ile birlikte kültüre edilmiştir. Durgun koşullar ile karşılaştırmalı olarak yürütülen 28 günlük dinamik kokültür sonunda Alamar Mavisi, RT-PCR, SEM ve CLSM analizleri gerçekleştirilmiş, en yüksek hücre aktivitesine ve farklılaşma belirteçlerine iki yönlü akış sağlayan yüksek akış hızlı sistemde ulaşılmıştır. Perfüzyon biyoreaktörler ile gerçekleştirilen çalışmalar hücre ekim stratejisinin, ön kültür süresinin, akış hızının ve yönünün başarılı sonuçlar alabilmek için çok önemli parametreler olduğunu ortaya koymuştur. İpek fibroin doku iskeleleri çözücü dökümü parçacık uzaklaştırma yöntemi ile üretilmiş ve biyoaktivitesini arttırmak amacı ile dinamik koşullarda derişik sentetik vücut sıvısı ile muamale edilerek mineralizasyon sağlanmıştır. Mineralize ipek iskelelerde perfüzyon biyoreaktör ile gerçekleştirilen tüm kokültür çalışmalarında düşük akış hızlı sistem kullanılmıştır. Tek aşamalı hücre ekimi ve 1 günlük ön kültür yaklaşımıyla gerçekleştirilen deneylerde, hücre tutunmasındaki sorunlara bağlı olarak perfüzyon biyoreaktörün hücreleri doku iskelesinden kopardığı görülmüştür. İki aşamalı hücre ekimi ve uzun ön kültür süresi yaklaşımıyla biyomalzeme hücre etkileşiminin iyileştirilmesi hedeflenmiştir. Analizlerden elde edilen sonuçlar düşük hızlı perfüzyon kokültürün ostejenik ve osteoklastik farklılaşma üzerine olumlu etkileri olmadığını ortaya koymuştur. Tez çalışmasının son bölümünde COMSOL yazılımı kullanılarak perfüzyon biyoreaktördeki akış ve kütle aktarım simülasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Doku iskelesi içermeyen biyoreaktörde düşük ve yüksek akış hızlı uygulamalar için geliştirilen modeller ile modelin doğruluğu test edilmiştir. Doku iskelesinin gözeneklerinde hücrelere etkiyen kayma gerilim değerlerinin hesabı için ideal gözenekli doku iskelesi modeli oluşturulmuştur. Düşük akış hızlı sistemde hücrelere etkiyen en yüksek kayma gerilimi 1.5980 x 10-4 dyne/cm2 olarak bulunurken, yüksek akış hızlı sistemde bu değer 2.0000 x 10-2 dyne/cm2'ye ulaşmıştır. Biyoreaktör ve doku iskelesi içindeki glikoz ve oksijen aktarımının simülasyonu için geçirgen doku iskelesi varsayımı ile hazırlanan modelden yararlanılmıştır. Yüksek akış hızında, iskele içindeki glikoz ve oksijen konsantrasyonları sırasıyla, 5.4907 mol/m3 ve 0.1881 mol/m3 olarak hesaplanmıştır. Düşük akış hızında ise bu değerler 1.5508 mol/m3 ve 0 mol/m3'e düşmüştür. Tez kapsamında gerçekleştirilen CFD modelleme çalışmalarından elde edilen sonuçların deneysel bulguları destekler nitelikte olduğu görülmüştür. Tüm bu sonuçlar ışığında, perfüzyon biyoreaktörde 6 mL/sa akış hızıyla osteoklast varlığında gerçekleştirilen kokültür yaklaşımının mezenkimal kök hücrelerin kitosan-HA SPHC'lerde osteojenik farklılaşmasında önemli yararlar sağladığı görülmüştür. Bununla birlikte mühendislik ürünü kemik yamalarının in vitro'da üretiminde başarılı sonuçların elde edilebilmesi için seçilen hücre kaynağının, doku iskelesinin, biyoreaktör çeşidinin ve işletim koşullarının belirleyici olduğunu sonucuna ulaşılmıştır.
Özet (Çeviri)
The aim of this study is to investigate the growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in tissue engineering bioreactors supported with scaffolds. For this purpose, chitosan-hydroxyapatite (HA) superporous hydrogel composites (chitosan-HA SPHCs) and mineralized silk scaffolds were used and dynamic culture studies were carried out with spinner flask bioreactors and perfusion bioreactors in comparison to static culture. Chitosan-HA SPHCs were synthesized by combining microwave irradiation and gas blowing techniques. The porous, three-dimensional structures of hydrogels were visualized by scanning electron microscopy (SEM) and micro-computed tomography (µCT) analyses. After a 28-day culture realized in the spinner flask bioreactor at 50 rpm stirring rate, mitochondrial activities and alkaline phosphatase activities of rat adipose tissue derived mesenchymal stem cells (rAdMSCs) were found to be comparable under static and dynamic conditions. SEM images demonstrated that cells attached to chitosan-HA SPHCs and produced mineralized nodules. However, it was noticed that cells did not cover the biomaterial surface. In order to obtain a more realistic in vitro model for bone tissue, human mesenchymal stem cells (hMSCs) and THP-1 cell line differentiated to osteoclasts were cocultured in perfusion bioreactors under two different flow rates (low rate, one-way flow: 0.0476 mL/h; and high rate, two-way flow: 6 mL/h). At the end of 28 days of dynamic coculture, Alamar Blue, RT-PCR, SEM and CLSM analyses were done, and the results demonstrated that the highest cellular activity and levels of differentiation markers were achieved in the high flow rate perfusion culture which provided by two-way flow. The studies with perfusion bioreactor emphasized the importance of cell seeding strategy, the duration of preculture period, the flow rate and direction to get successful results in dynamic cultures. Silk fibroin scaffolds were fabricated by solvent casting particulate leaching method and to enhance bioactivity they were mineralized by concentrated simulated body fluid (SBF) under dynamic conditions. Perfusion culture studies carried out with mineralized silk scaffolds were performed under low-rate conditions. The experiments with one-step cell seeding and one-day preculture period resulted cell wash-out with perfusion due to weak cell adhesion. Thus, a two-step cell seeding approach with longer preculture period was used for enhancing cell-biomaterial interactions. The results showed that low rate perfusion coculture had no significant positive effects on osteogenic and osteoclastic differentiation. In the last part of the study, CFD (Computational Fluid Dynamics) simulations were performed by using COMSOL software to model the flow and mass transfer within the perfusion bioreactor. Validation was done by building models for the perfusion bioreactor operating under low and high flow rates in the absence of a tissue scaffold. To determine the shear stress values acting on the cells within the pores, a scaffold model with ideal pore structure was built. The maximum shear stress acting on cells under low-rate perfusion was found to be 1.5980 x 10-4 dyne/cm2, whereas, under high rate, it was determined as 2.000 x 10-2 dyne/cm2. Glucose and oxygen transfer within the bioreactor and scaffold was simulated by the use of the model built by assuming a permeable scaffold structure. In the high flow rate system, glucose and oxygen concentration values were calculated as 5.4907 mol/m3 and 0.1881 mol/m3, respectively. The values were dropped to 1.5508 mol/m3 ve 0 mol/m3 for glucose and oxygen, respectively, in the low flow rate perfusion bioreactor. It was seen that the results of the present CFD modelling studies supported the earlier findings obtained from experimental studies. In the light of these findings, it can be stated that the coculture approach with the use of a perfusion bioreactor at 6 mL/h flow rate and osteoclasts provided several advantages for the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. However, it is concluded that the selection of cell source, scaffold, bioreactor type and operating parameters were critical parameters for achieving success in the production of engineered bone grafts in vitro.
Benzer Tezler
- Assessment of the effects of melatonin on the funtional deficits induced by cellular stress in obese donor derived mesenchymal STEM cells
Melatonin'in obez donor mezenkimal kök hücrelerinde hücresel strese bağlı olarak oluşan fonksiyon bozuklukları üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi
ECE GİZEM POLAT
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
BiyolojiHacettepe ÜniversitesiKök Hücre Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATİMA SUSANNA FAUSTINA AERTS KAYA
- Nörofibromatozis tip 1(NF1) kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin detaylı karakterizasyonu
Characterisation of mesenchymal stromal cells derived from neurofibromatosis TYPE 1 (NF1)
İREM AKAR
- Mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasına fungal beta-glukanın etkilerinin incelenmesi
The effects of fungal beta-glucan on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells
LEYLA KAYİŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyoteknolojiKocaeli ÜniversitesiKök Hücre ve Doku Yenilenmesi Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. GÖKHAN DURUKSU
- Doku mühendisliğinde kullanılmak üzere metalik ve biyojenik nanopartiküllerin somatik ve kök hücreler üzerindeki etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of metallic and biogenic nanoparticles on somatic and stem cells for the purpose of using for bioengineering applications
SERAP YEŞİLKIR BAYDAR
Doktora
Türkçe
2016
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MALAHAT BAGHIROVA
- Role of DNA topoisomerase IIβ in osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
İnsan mezenkimal kök hücrelerinin osteogenik farklılaşmasında DNA topoizomeraz IIβ'nın rolü
AYSEL KARAGÖZ
Doktora
İngilizce
2017
Genetikİstanbul ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK