Structural modelling and functional analysis of the engineered small heat-shock protein,TPV-HSP14.3 from Thermoplasma volcanium
Thermoplasma volcanıum'un modifiye edilmiş küçük ısı şoku proteini TPV-HSP14.3 yapı modellemesi ve işlevsel analizi
- Tez No: 371730
- Danışmanlar: PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 282
Özet
Bu çalışmada, termoasidofilik bir Arkeabakteri olan Thermoplasma volcanium'un küçük ısı şok proteini (sHSP) incelenmiştir. sHSP proteinler çeşitli stress koşullarında konakçı organizmanın hücresel proteomunu korumak ve hayatta kalmasını sağlamakta etkin olan düşük moleküler ağırlıklı proteinlerdir. Bu proteinin yapı-fonksyon analizi için deneysel yaklasim ve hesaplamalı yöntemler kullanılmıştır. Tpv-Hsp14.3 ile onunla yakından ilgili sHSP'ler ile yapılan dizi hizalamaları bir çekirdek α-kristalin alanı ve C-termina ucun ortasındaki bir V/I/L-X-V/I/L motifin yüksek oranda korunduğunu gösterilmiştir. Hesaplamalı ikincil yapı tahmini sonuçları, kanonik sınıf II Shsp'ler de olduğu gibi α-heliks yapısında bir N-terminal ve kısa bir ikincil yapısı olan C-ucu arasında sekiz β-iplikçikten oluşan bir çekirdek α-kristalin alanı bulunduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar, tpv-Hsp14.3'ün hesaplamalı yöntemlerle tahmin edilen 3 boyutlu yapısı ile de doğrulanmıştır. 3D yapı modeli analizi tpv-Hsp14.3 monomerlerinin β6 ipliklerinin takası yolu ile dimerleştiğini göstermiş olup, bunlar daha sonra etkileşerek oligomerler oluşturmakta ve protein substratları bu yolla stresten korumaktadırlar. Bu güne dek çalışılmış sHSP lerle farklı düzeylerde dizi hizalamaları ve yapı karşılaştırma çalışmaları yolu ile dimer oluşumu ve şaperon fonksyonuna katkıda bulunan önemli gruplar belirlenmiştir. Bunlar, R69 (R69K, R69E ve R69M değiştirilmesi için), R81 (R81K, R81E ve R81M olarak değiştirilmesi için), K87 (K87R, K87E ve K87I olarak değiştirilmesi için), ve QR(80-81) [(QR(80-81)EL olarak değiştirilek için)] guruplarıdır. Seçilen grupların kendi benzerleri, negative yüklü olanlar ve hidrofobik olanlarla yer değiştirmesi, bölgeye özel mutagenezle yapılmıştır. Daha sonra, mutantlar ve yaban tip protein, E.coli'de ifade edilmiş ve afinite kolon kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Mutantların şaperon fonksiyonundaki değişikliği görmek için, domuz kalbi Sitrat Sentaz (CS) enzimi model olarak kulanılmıştır. CS, yaban tip ve sHSP mutant varyantları ile ayrı ayrı denaturasyon sıcaklığında (47°C) inkübe edilmiştir. Enzim aktivitesi CS için optimum sıcaklık olan 35°C'de ölçülmüştür. Enzim aktivite deney sonuçları R69E, R69K, K87R ve K87I mutant sHSP'lerin şaperon aktivitelerinin yaban tipe göre sırası ile 1.9-, 1.8-, 2.6- ve 2.7-kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Yaban tip tpv-Hsp14.3 ile karşılastırdığında K87E ve QR(80-81)EL mutantları'nın CS için şaperon aktiviteleri sırasıyla 1.2- ve 1.3-kat gibi az bir artış göstermiştir. Diğer taraftan, R69M ve R81K mutant sHSP ile inkübe edilen CS enziminin aktivitesi, yaban tiple ınkübasyona göre sırası ile 0.9 ve 0.6 kat daha az bulunmuştur. CS R81E ve R81M ile inkübe edildiğinde, yabani tip tpv-Hsp14.3 ile inkübasyona göre aktivitesi önemli ölçüde değişmiştir. Son olarak, dinamik ışık saçılımı (DLS) Spektroskopisi ile çözelti içinde tpv-Hsp14.3 yabani tip ve mutant varyantlarının oligomer dinamikleri çalışılmıştır. Bunun için, DLS iki farklı koşulda gerçekleştirilmiştir: biricisinde yaban tip tpv-Hsp14.3 tek başına ve domuz kalbi CS enzimi ya da sığır glutamat dehidrojenaz (GDH) enzimi ile bu enzimlerin aktivitelerini kaybettikleri sıcaklıklarda inkübe edilmiştir. İkinci durumda, yaban tip tpv-Hsp14.3 ve mutant varyantları, 20°C, 35°C, 45°C ve 60°C'de 10 dakika inkübe edilmiş ve DLS ölçümleri alınmıştır. Daha sonra, bu veriler oligomerlerin çözelti içindeki boyutlarını temsil eden hidrasyon yarıçaplarına (Rh) dönüştürülmüş ve bunların dağılımı tepe noktaları olarak kaydedilmiştir. Bu sonuçlara göre, Rh değerleri sıcaklık artışı ile giderek azalma ve tepe nokta sayısının tek bir esas ana tepe noktasında indirgenme şekline genel eğilim gözlenmiştir.
Özet (Çeviri)
In this study, a small heat shock protein tpv-Hsp14.3 from a thermoacidophilic Archaeon, Thermoplasma volcanium was studied. sHSPs are low molecular weight proteins involved in different stress responses to protect the cellular proteome and enhance survival of the host organism. For structure-function analysis of the protein, both experimental and computational tools were used. Sequence alignments with closely-related sHSPs showed high sequence conservation at the core α-Crystalline domain and a V/I/L-X-V/I/L motif in the middle of the C-terminus. Computational results for secondary structure prediction showed a canonical class II sHSP with nine β-strands, which constitute the core α-Crystalline domain, flanked by an N-terminal α-helix and a short coiled coil secondary structure at the C-Terminus. These results were confirmed by the predicted three-dimensional (3D) of the tpv-Hsp14.3. 3D model analysis showed that sHSP protein monomers are interacting by means of β6-strand swapping to dimerize, and then form higher order oligomers which interact and protect the protein substrates under stress conditions. Sequence alignments at different levels and structure comparison with the sHSPs studies so far were carried out to determine important residues involved in dimer formation and chaperoning function. From these studies, three single-residue, and a double-residue were determined for mutagenesis. They were: R69, to be changed into R69K, R69E, and R69M; R81 to be changed into R81K, R81E and R81M; K87 to be changed into K87R, K87E and K87I; and QR(80-81) to be changed into QR(80-81)EL. To this end, site-directed mutagenesis was performed to change the selected residues into analogs, negatively-charged, and hydrophobic residues. Then the mutants and the wild-type proteins were expressed in E.coli and purified by affinity column chromatography. To see the change in the chaperoning function of the mutants, pig heart Citrate Synthase (CS) was used as model enzyme. CS was incubated with both, wild-type and each one of the sHSP mutant variants at denaturing temperature (47°C). The initial activity then was measured at 35°C which is the optimum temperature for CS. The enzyme assay results showed that the enzyme activities of mutant variants R69E, R69K, K87R and K87I, increased by 1.9-, 1.8-, 2.6- and 2.7-fold respectively, compared to CS activity incubated with the wild-type tpv-Hsp14.3. K87E and QR(80-81)EL mutants had a slight increased CS activity (1.2- and 1.3-fold respectively) as compared to the wild-type tpv-Hsp14.3. On the other hand, CS activities when incubated with R69M and R81K mutant variants were 0.9- and 0.6-fold lower, respecively than CS incubated with the wild-type chaperone. CS activity when the enzyme was incubated with R81E and R81M mutants did not significantly change as compared to CS activity when the enzyme was incubated alone at 47°C. Finally, Dynamic Light Scattering (DLS) Spectroscopy was used to study the oligomer dynamics of wild-type and mutant variants of tpv-Hsp14.3 in solution. DLS was carried out under two different conditions: In the first, the wild-type tpv-Hsp14.3 was incubated alone and with pig heart CS or Bovine Glutamate Dehydrogenase (GDH) substrates enzymes at temperatures where the two enzymes lose their activities rapidly. In the second case, the wild-type tpv-Hsp14.3 and the mutant variants were incubated at 20°C, 35°C, 45°C and 60°C for 10 minutes separately and DLS measurements were taken. Then, these data were converted into hydration radius (Rh) values which represent sizes of the oligomers in the solution and their distribution were recorded as peaks. According to these results, there was a general trend of decreasing in Rh size with increasing the temperature reducing in the number of peaks towards a single main peak.
Benzer Tezler
- Helisel dişli çarkların autocad ortamında ADS ile interaktif tasarımı
Computer aided interactiv design for helical gears in autocad with ADS
ŞERAFETTİN ENGİN
- Bilgisayar destekli tasarımda sonlu eleman analizi için otomatik ağ yapısı oluşturulması
Automatic mesh generation techniques for finite element analysis
DERYA VAROL
- Kiriş problemleri sonlu elemanlar yöntemi ile çözümü
The Solution of beam problems with finite element method
OSAMA A.SALEH ABDALLA
- MTR tipi yakıt elemanı kullanılan araştırma reaktörlerinde soğutucu kanalı tıkanması kazası analizi
Channel blockage accident analysis for research reractor with MTR type fuel elements
AYHAN YILMAZER
Yüksek Lisans
Türkçe
1997
Nükleer Mühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiNükleer Enerji Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HASBİ YAVUZ
- Sonlu elemanlar metodu yardımıyla nokta direnç kaynağının soğuma analizi
The finite element modeling of the thermal distribution obtained resistance spot welding results
LÜTFİYE ÇEBİ
Yüksek Lisans
Türkçe
1997
Makine Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MURAT VURAL