Interrogating the function of chromatin modifying enzymes in TRAIL response of GBMs
GBM'lerin TRAIL'a cevabında kromatin modifiye-edici enzimlerin fonksiyonlarının araştırılması
- Tez No: 397246
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. TUĞBA BAĞCI ÖNDER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Moleküler Tıp, Onkoloji, Genetics, Molecular Medicine, Oncology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 117
Özet
Glioblastoma multiforme (GBM), çok kısıtlı tedavi opsiyonları olan agresif bir beyin kanseridir. GBM hastalarının yaşam süreleri tanı sonrası 12 ay civarındadır. GBM, invaziv doğasından ve kan beyin bariyerinin (KBB) teröpatik ajanlara karşı limitli geçirgen yapısından dolayı zayıf bir prognoz sergilemektedir. Intrakranial tümörlerin cerrahi rezeksiyonu da güvenlik kaygıları nedeniyle sınırlıdır. Tümör-nekroz-faktör ilişkili apoptoz indükleyici ligand (TRAIL), sağlıklı hücrelere zarar vermeden sadece tümör hücrelerini hedef alarak programlı hücre ölümünü tetiklediği için ümit verici bir teröpatik ajandır. Buna rağmen, TRAIL-bazlı tedavilerde karşılaşılan büyük engellerden biri farklı tümör doku hücrelerinin TRAIL'a karşı farklı duyarlılık göstermeleridir. Tümör hücrelerinin bu yüksek değişken davranışı, TRAIL direncinde farklı seviyelere yol açan, apoptozda rol alan elemanların farklı düzenlenmesinden kaynaklanmaktadır. Ortaya çıkan sonuçlar, TRAIL-direnci ile apoptotik programın temel bileşenlerinin anormal ifadesi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu komponentlerin epigenetik seviyede nasıl düzenlendikleri henüz tam olarak bilinmemektedir. Bütün genlerin transkripsiyon düzeyinde sıkıca kontrol edilmeleri, epigenetik modifiye edici enzimler ile uyum içerisinde çalışan ana transkripsiyon faktörlerinin denetimi altında olduğu için, kromatin modifiye-edici enzimlerin fonksiyonlarını değerlendirmek ve TRAIL yanıtını düzenleyen kromatin-bazlı yeni mekanizmaları tanımlamak amacıyla bir“short-hairpin RNA”(shRNA) taraması gerçekleştirildi. DNA'da ve histon modifikasyon yolağındaki 47 genin rolünü sorgulamak için 2-3 shRNA/gen kullanıldı. Buna dayanarak; DNA-metiltransferazları (DNMTs), Histon-metiltransferazları (HMTs), Metil-DNA bağlayıcı proteinleri ve Polikomb kompleks üyeleri (PrC) test edildi. Birbirinden farklı shRNA'ların enfekte edilmesi ile, U87MG hücrelerinde TRAIL cevabı canlılık deneyleri ile test edildi. Sonuç olarak, sırasıyla bir H3K36-spesifik demetilaz ve bir H2AK119'un E3 ubikitin-protein ligazı olan KDM2B ve RING1A'yı TRAIL cevabında yeni bir düzenleyici olarak tanımlandı. Çalışmalarımızda KDM2B'ye odaklanıldı. Buna göre, KDM2B'nin susturulması TRAIL duyarlılığını, kaspaz-8, kaspaz-3, kaspaz-7 ve kesilmiş PARP'ı anlamlı bir biçimde artırdı. KDM2B susturulmasının apoptotik süreci hızlandırdığı canlı hücre görüntüleme ve gerçek zamanlı hücre analizi deneyleri ile ortaya konuldu. Ayrıca, eş zamanlı olarak KDM2B'nin tersine modifikasyonunun katalizlenmesinden sorumlu metiltransferazların susturulmasının, KDM2B inhibisyonuyla gerçekleşen fenotipi geri döndürdüğü gözlendi. KDM2B tarafından düzenlenen moleküler yolağı deşifre etmek amacıyla, apoptozla ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerini RNA-sekanslama ve kantitatif RT-PCR ile test edildi ve KDM2B'nin susturulması ile pro-apoptotik genler olan HRK, DR4 ve kaspaz 7'nin arttığı ve anti-apoptotik gen Mcl-1'in baskılandığı gözlemlendi. İmmün-baskılanmış farelere yapılan deri altı susturulmuş-KDM2B ve kontrol hücre enjeksiyonları da KDM2B'nin tümör büyümesini ve anjiyogenezi anlamlı şekilde etkilediğini gösterdi. Birlikte ele alındığında, bulgularımız GBM hücrelerinde yeni bir mekanizmayı; apoptozun kilit bileşenlerinin KDM2B'nin epigenetik kontrolü altında olduğunu önermektedir. Dolayısıyla, KDM2B'nin doğrudan DNA hedeflerinin belirlenmesi, GBM'lerde apoptoz yanıtının anlaşılmasında ve başarılı bir pro-apoptotik terapi tasarımının yardımında yeni bir anlayış sağlayabilir.
Özet (Çeviri)
Glioblastoma multiforme (GBM) is an aggressive brain cancer with very limited treatment options. Average survival rate of the patients diagnosed with GBM is around 12 months. The invasive nature of GBMs and the presence of the blood brain barrier (BBB) that limits the delivery of therapeutic agents are among the obstacles for the poor prognosis of GBMs. Surgical resection of the intracranial tumors are also limited due to safety concerns. Tumor-necrosis-factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a promising therapeutic bioagent that can target invasive GBM cells in the brain when delivered locally, and program tumor cells for cell death while leaving healthy cells untouched. However, a major obstacle against TRAIL-based therapies is that different tumor cells of a single tumor tissue or different tumors, exhibit differential sensitivity against TRAIL. This highly versatile behavior of the tumor cells is believed to be due to differential regulation of apoptosis mediators. Emerging evidence suggests that TRAIL-resistance is associated with the aberrant expression of the key components of the apoptotic program. However, how these components are regulated at an epigenetic level is not understood. Since transcription levels of all genes are tightly regulated under the control of master transcription factors in concert with epigenetic modifying enzymes, we conducted a short-hairpin RNA (shRNA) screen to assess the function of chromatin modifying-enzymes and aimed to identify novel chromatin-based mechanisms regulating the TRAIL response. We employed 2-3 shRNAs/gene to interrogate the role of 47 genes in DNA and histone modification pathways. Accordingly, we tested shRNAs targeting DNA-methyltransferases (DNMTs), Histone-Methyltransferases (HMTs), Histone demethylases (HDMs), Methyl-DNA binding proteins, and Polycomb complex members (PrC). Upon infection with individual shRNAs, GBM cells were tested for their TRAIL response using viability assays. As a result, we identified KDM2B and RING1A, an H3K36-specific demethylase and a E3 ubiquitin-protein ligase of H2AK119 respectively, as novel regulators of TRAIL response. We then focused our studies on KDM2B. Accordingly, silencing of KDM2B significantly enhanced TRAIL sensitivity, and activated caspase-8, caspase-3, caspase-7. Also, KDM2B knockdown accelerated the apoptosis process, as revealed by live cell imaging and real-time cell analyses. Moreover, simultaneous knockdown of the methyltransferases responsible for catalyzing the reverse modification of KDM2B significantly recovered the cell death phenotype observed with KDM2B inhibition. In order to decipher the downstream molecular pathways regulated by KDM2B, we examined the expression levels of apoptosis-related genes by RNA-seq and quantitative RT-PCR and observed de-repression of pro-apoptotic genes HRK, caspase-7, DR4 and repression of anti-apoptotic gene Mcl-1 upon KDM2B silencing. We also observed that KDM2B-silenced tumors exhibited slower growth compared to controls in vivo. Taken together, our findings suggest a novel mechanism, where the key apoptosis components are under epigenetic control of KDM2B in GBM cells. Therefore, identifying the direct DNA targets of KDM2B might provide a new understanding of apoptosis response in GBMs and aid in the design of successful pro-apoptotic therapies.
Benzer Tezler
- Tek merkezden denetlenen çok PLC'li bir sistemin tekstil boyama prosesinin otomasyonunda kullanımı
Application of a central controlled multi PLC system to the textile dyeing process
MUVAFFAK AMASYA
Yüksek Lisans
Türkçe
1995
Elektrik ve Elektronik Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiDOÇ. DR. MEHMET BÜLENT ÖRENCİK
- V-diyagramları'nın 10. sınıf öğrencilerinin 'Mekanik dalgalar' konusundaki başarılarına etkisi
The effect of V-diagrams on success of 10th grade students in 'the mechanical waves? subject
HANİFE TEKEŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
Fizik ve Fizik MühendisliğiDicle ÜniversitesiFizik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SELAHATTİN GÖNEN
- Romatoid artritli hastalarda anti-siklik sitrulinlenmiş peptid (CCP) antikorunun tanısal değeri ve hastalık aktivitesi ile ilişkisi
Diagnostic value and relationship with disease activity of anti-cyclic citrullinated peptide (ccp) antibodies in rheumatoid arthritis patients
IRMAK BARAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2007
MikrobiyolojiSağlık BakanlığıMikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SEBAHAT AKSARAY
- Güvenli şekilde dost uçakları tanıma
Secure identification friendly aircraft
BUSE TEKİN AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrolİstanbul Teknik ÜniversitesiBilişim Uygulamaları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ENVER ÖZDEMİR