Expressional protein profiling of MCF-7 breast cancer epithelial cells upon BAG-1 overexpression
BAG-1 proteininin fazla ifade edildiği MCF-7 epitel kanser hücrelerinin proteomik analizi
- Tez No: 397979
- Danışmanlar: DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Onkoloji, Biology, Oncology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 128
Özet
BAG-1, Bcl-2 asosiye athano gen (Bag)-ailesine mensup bir proteindir. Bu aile üyelerinde başka moleküllerle etkileşimde görevli olan 'BAG domeni' ortaktır. Her üye farklı amino uçlarına sahip olduğu için proteinlerle etkileşimi ve yolaklardaki etkisi farklılık gösterir. BAG protein ailesi apoptozdan tümör oluşumuna kadar birçok farklı mekanizmada görev almaktadır. İnsanlarda BAG protein ailesi içerisinde BAG-1 (izoformlarıyla), BAG-2, BAG-3, BAG-4, BAG-5 ve BAG-6 proteinleri bulunur. BAG-1 proteini proliferasyon, sağ-kalım, transkripsiyon, apoptoz, metastaz ve motilite gibi birçok hücresel mekanizmada, Bcl-2, nüklear reseptörler, Hsp70/Hsc70, Raf-1, Rb, Proteazom, GADD34 ve HGFR gibi birçok molekül ile etkileşerek görev alır. BAG-1 geni, insanda 9. kromozomun 12. bantında yer almaktadır ve 7 ekzona sahip 3885 bazlık bir mRNA tarafından kodlar. Bu mRNA'dan alternatif translasyon mekanizması ile amino uçları farklı birden fazla BAG-1 izoformu sentezlenir. İnsanda toplam dört tane BAG-1 izoformu bulunmaktadır. BAG-1S, AUG kodonundan, daha büyük moleküler kütleye sahip olan BAG-1L ve BAG-1M proteinleri ise daha yukarıda kalan sırasıyla, CUG ve AUG kodonlarından sentezlenir. Dördüncü izoform 29 kDa ağırlığına sahiptir ve hücre içi miktarı diğer üç izoforma göre oldukça düşüktür. Bütün izoformlarda, C-ucundaki BAG domeni (BD)'ye ek olarak ubikuitin-benzeri (ULD) domeni bulunmaktadır. Yapılan çalışmalar ışığında henüz ULD domeninin fonksiyonu kesin olarak aydınlatılamamıştır; fakat evrimsel olarak korunduğu ve stres toleransında görev aldığı düşünülmektedir. BAG-1L nükleusa lokalize olmasını sağlayan nüklear lokalizasyon sinyali (NLS) taşımaktadır. BAG-1S NLS içermez ve sitoplazmada bulunur. BAG-1M nüklear lokalizasyon sinyalinin bir parçasını taşır ve bu da BAG-1M'nin sitoplazma ve nükleusda birlikte bulunmasını açıklamaktadır. BAG-1 izoformlarının hücre tiplerine göre farklı anlatım düzeyleri gösterdikleri bilinmektedir. Hücrede en fazla bulunan izoform BAG-1L'dir sonra BAG-1M ve BAG-1S en az bulunan ise minor izoformudur. Ayrıca, bazı tümörlü hücrelerde BAG-1L'nin anlatımının en yüksek olduğu bilinmektedir. BAG-1; proliferasyon, sağ-kalım, transkripsiyon, apoptoz, metastaz ve motilite gibi birçok hücresel mekanizmada rol almaktadır. Bcl-2, nüklear reseptörler, Hsp70/Hsc70, Raf-1, Rb, Proteazom, GADD34 ve HGFR gibi birçok hedef molekül ile etkileşime geçer. BAG-1 izoformları, hücre homeostazını Hsp70/Hsc70 şaperon sistemiyle etkileşerek veya bu şaperon sistemiyle etkileşmeden düzenler. BAG domeini, BAG-1'ın ısı şok proteinleri Hsp70 ve Hsc70 ile etkileşim kurmasında aracı olur. Bu etkileşim, denatüre substrat proteinlerin katlanmasına yardımcı olarak hücrenin stres koşulları ile baş edebilmesini sağlar. BAG domeninin, ısı şok proteinlerin ATPaz domenine bağlanarak, substrat proteinleri ile olan bağlanma ve ayrılma kinetiklerini kontrol ettiği ve şaperonun aktivitesini artırdığı düşünülmektedir. BAG domeninin etkileşim halinde olduğu moleküllerden biri de serin/treonin protein kinaz Raf-1'dır. Bu etkileşim BAG-1'in hücre sağkalımı ve apoptoz dengesinde önemli olduğunu göstermektedir ki hücrenin normal ve stres halleri arasındaki dengesinin yönü BAG-1'e, Hsp70 ya da Raf-1'in yarışmalı bağlanmasına bağlıdır. Yapılan çalışmalar, BAG-1'in Raf-1 ile direkt etkileşime geçerek Raf-1'i aktive ettiğini ve hücreyi sağkalıma yönlendirdiğini işaret etmektedir. BAG-1'nın diğer etkileşim partneri ise Bcl-2'dir. BAG-1, Bcl-2'nin aktivitesini arttırır ve mitokondrideki Bcl-2 lokalizasyonunu destekler. Mitokondrideki bu artış, Bcl-2'nin apoptotik Bad proteini tarafından inhibisyonunu önler ve böylece, serbest Bcl-2, apoptotik Bax proteinine bağlanarak heterodimer oluşturur böylece Bax'ın mitokondriye girişini engeller ve apoptozu önler. BAG-1'nın diğer etkileşim partnerleri proteozomal degradasyon için proteinleri işaretlemede görevli CHIP ve SIAH proteinleridir. Kanserli hücrelerde BAG-1 anlatım seviyesinin arttığı bilinmektedir, BAG-1'in etkileştiği partnerler irdelendiğinde hücrenin sağkalıma yönlendirilmesinde BAG-1'in önemli bir role sahip olduğu düşünülmektedir. Kanserli hücrelerde BAG-1 anlatımı ve klinik önemi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır ve bu çalışmalar özellikle meme kanseri üzerine yoğunlaşmıştır. Bilindiği gibi meme kanseri dünya çapında kadınlarda en sık görülen kanser çeşitidir. Bu nedenle meme kanserinde, erken teşhis ve yeni biyomarkırların keşfi hala önemini korumaktadır. BAG-1 proteinin meme kanserinde anlatımının arttığı ve hastaların sağkalım oranında etkisinin olduğu çeşitli çalışmalar ile gösterilmiştir ancak BAG-1'in hangi moleküler yolaklarda yer aldığı tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu noktada, BAG-1'in hangi yolaklarda ve nasıl görev aldığı merak konusudur ve aydınlatılması önem teşkil etmektedir. Bu çalışmanın amacı, BAG-1 ekspresyonundan etkilenen proteinleri ve kanser yol izlerini keşfetmektir. Bu doğrultuda MCF-7 hücresine ait protein ekpresyon profili, total proteinleri izoelektrik noktasına ve moleküler ağırlığına göre ayıran iki boyutlu jel elektroforez tekniğini kullanılarak analiz edilmiştir. MCF-7 hücrelerinde BAG-1 bağlantılı moleküler yolakları tespit etmek amacı ile öncelikle, MCF-7 hücreleri Bag-1 cDNA'sını içeren plasmid ile transfekte edildi sonra BAG-1'in aşırı ifade edildiği hücrelerden ve kontrol grubu olarak anılan transfekte edilmemiş hücrelerden total protein izolasyonu gerçekleştirildi ve bu örneklere immun-blotlama tekniği uygulandı. İki farklı protein örneği için 3 replika olacak şekilde iki boyutlu jel elektroforez uygulandı. İkinci adım olarak, MCF-7 meme epitel hücrelerinde, aşırı BAG-1 ekspresyonuna bağlı olarak farklı ekspres edilmiş proteinleri belirleyebilmek için, PDQuest Advanced 8.0.1 programı kullanılarak jeller analiz edildi. Analiz sonucunda, BAG-1'in aşırı ifade olduğu MCF-7 meme epitel hücrelerinde, 26 proteinin ifade farklılığı gösterdiği tespit eilmiştir. Üçüncü adım olarak, proteinlerin kesin olarak belirlenebilmesi için, jel üzerindeki spotlar kesilip kütle spektrometrisi yöntemi ile incelenmiştir. Kütle spektrometresinden gelen sonuçlar doğrultusunda ERp57 (Endoplazmik retikulum protein 57) ve ERp29 (Endoplazmik retikulum protein 29) proteinlerinin anlatımının, BAG-1'in aşırı ifade edildiği hücrelerde kontrol grubuna kıyasla kayda değer bir şekilde arttığı bulunmuştur. ERp57/PDIA3 (57 kDa) protein disülfit izomeraz (PDI) ailesine ait bir proteindir. ERp57'nin PDI ile %56 benzerlik gösterdiği ve %29 amino asitin aynı olduğu bilinmektedir. ERp57'nin sinyal peptiti olan 24 amino asit dışında 481 amino asitten oluştuğu bilinmektedir. ERp57'nin ilk olarak glikoz tükendiğinde K12 hücrelerinde aşırı ifade edildiği bilinmektedir ve bu durum başka hücre tiplerinde başka stres şartları için onaylanmıştır. Stres şartlarına bağlı olarak ERp57 anlatım seviyesindeki değişim tam olarak aydınlatılmamıştır; lakin, anlatımının, katlanmamış protein cevabına (UPR) karşılık olarak arttığı bilinmektedir. ERp29, PDI-benzeri endoplazmik retikulumda (ER) bulunan bir proteindir. Bu protein 261 amino asitten oluşmaktadır ve çoğunlukla salgılayıcı dokularda bulunmaktadır. Hücre UPR'a gittiğinde üretim seviyesi yükselmektedir ve hücre korumasında görev almaktadır. ERp29 gen promotoru ER-stres cevap elementi (CCACG) promotor bölgesinde taşımamaktadır ve bu transkripsiyonunun ER-stres ile tamamen etkileşmediğini gösterir. Bir başka çalışmaya göre, ERp29'un tümörü baskılayıcı bir fonksiyona sahip olduğu tahmin edilmektedir. ERp29 proteinin bazı primer kanser tiplerinde fazla ekspres edildiği bilinmektedir; fakat çelişkili sonuçlar nedeniyle ERp29'un tümör oluşumundaki fonksiyonu tam olarak çözülememiştir. Örneğin, invazif olmayan MCF-7 meme hücrelerinde ERp29 ekspresyonu inhibe edildiğinde tümör oluşumunun düştüğü; fakat, bir başka çalışmada tümör oluşumunu bastırdığı gözlemlenmiştir. BAG-1 aşırı ekspresyonuna bağlı olarak bu proteinlerinin seviyesinin artışı Western blot tekniği ile onaylanmıştır. BAG-1 anti-apoptotik bir protein olduğu için, farklı ekspres olmuş proteinlerin meme kanserinde gelişmiş sağ-kalım ile ilgili olabileceği kanısına varılmıştır.
Özet (Çeviri)
BAG-1 is an anti-apoptotic protein, which belongs to BAG family. These proteins serve several functions including apoptosis, cell survival, cell motility and tumorigenesis. In human, there are six BAG-family members, which are BAG1 (and its isoforms), BAG-2, BAG-3, BAG-4, BAG-5, and BAG-6. Bag-1 gene consists of 7 exons and is located on chromosome 9. There are different isoforms of BAG-1, such as BAG-1S, M, L and a minor isoform. These isoforms are produced by alternative translation from a single mRNA. While BAG-1S initiates at an internal AUG codon, the translation of the larger BAG-1L and BAG-1M proteins initiate at the upstream CUG and AUG codons, respectively. BAG-1's diverse functions include; proliferation, survival, transcription, apoptosis, metastasis, and motility, which are investigated in many cancer studies. There are several studies highlighting the expression and clinical significance of BAG-1 in cancer, and these studies mostly focus on breast cancer. As known, breast cancer is the most common type of cancer in women worldwide so improvements of early and precise detection maintain its importance. For this reason, in this study, we aim to reveal cell survival related pathways in breast tumorigenesis by using BAG-1 as an anti-apoptotic modulator in the cell. To do that, we overexpressed BAG-1 in MCF-7 breast cancer cell line and using proteomic approaches, we compared the expression profiles of BAG-1 overexpressed cells with untreated MCF-7 cells. Our results showed that the intracellular amount of two endoplasmic reticulum proteins, PDIA3 and ERp29, are upregulated in BAG-1 overexpressed MCF-7 cells. Western blot analysis was used to confirm the expression levels of these proteins upon BAG-1 overexpression. Moreover, the presence of ER stress was controlled utilizing western blot for PDI protein. We observed that PDI protein level increases when BAG-1 is upregulated in the cell. This study proposed that BAG-1 protein may be an important ER stress factor inducing cell survival.
Benzer Tezler
- Meme kanseri kök hücrelerinde histon modifikasyonları ile hücre ölümü arasındaki ilişkilerin araştırılması
Investigating the dynamics between histone modifications and cell death in breast cancer stem cells
NAZLIHAN AZTOPAL
- MİR-122-5P ve onun hedeflediği adam10 gen ifadelerinin insan meme kanseri ile ilişkisi
The association of the expressions of MIR-122-5P and its target adam10 gene with human breast cancer
SERCAN ERGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
Tıbbi BiyolojiGaziantep ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. SERDAR ÖZTUZCU
- Investigating protein variations of Bag-1 in wild type and Bag-1 knockout MCF-7 breast cancer cells
Doğal tip ve Bag-1 silinmiş MCF-7 meme kanseri hücrelerinde Bag-1'ın protein değişikliklerinin incelenmesi
PELİN ÖZFİLİZ KILBAŞ
Doktora
İngilizce
2022
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
PROF. DR. ELİF DAMLA ARISAN
- Molecular mechanisms of vincristine and paclitaxel resistance in MCF-7 cell line
MCF-7 hücre hattında paklitaksel ve vinkristin dirençliliğinin moleküler mekanizmaları
MELTEM DEMİREL KARS
Doktora
İngilizce
2008
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Bölümü
PROF. DR. ALİ UĞUR URAL
PROF. DR. UFUK GÜNDÜZ
- Curcuminin otokrin büyüme hormonu (BH) anlatımı kazandırılmış MCF-7 meme kanseri hücrelerinde endoplazmik retikulum stres ve otofajik yolaklar üzerine etkisinin irdelenmesi
Investigation of the effect of curcumin on endoplasmic reticulum stress and autophagic pathways in the autocrine growth hormone (GH) MCF-7 breast cancer cells
MERVE KARATAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Biyolojiİstanbul Kültür ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AJDA ÇOKER GÜRKAN