Endüstriyel kullanıma uygun, termostabil rekombinant alfa amilaz ve beta amilaz enzimlerinin eş zamanlı bakteriyel ekspresyon ile üretilmesi
Production of recombinant thermostable alpha and beta amylase enzymes via dual expression suitable for industrial usage
- Tez No: 398796
- Danışmanlar: PROF. DR. HİKMET MURAT SİPAHİOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Ziraat, Agriculture
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yüzüncü Yıl Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 91
Özet
Sıcaklığa dayanıklı amilazlar nişasta endüstrisi başta olmak üzere; gıda, yem, kağıt, tekstil, deri ve deterjan üretimi gibi alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte termostabil amilaz enzimlerinin üretimi, birçok hipertermofilik mikroorganizmada endüstriyel kullanım için düşük miktardadır. Yürütülen bu çalışmada termostabil α ve β amilaz enzimlerinden sorumlu genler spesifik gen kaynaklarından izole edilerek iki farklı klonlama bölgesine sahip pET-Duet-1 ekspresyon vektörüne aktarılmış ve elektroporasyon yöntemi ile Escherichia coli BL21 kompetan hücrelerine transforme edilmiştir. Gen kaynağı olarak, α amilaz geni için Bacillus stearothermophilus DSM 22 ve β amilaz geni için ise Thermoanaerobacterium (Clostridium) thermosulfurogenes DSM 2229 suşlarının genomik DNA'ları kullanılmıştır. Rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterileri nişasta içeren ampisilinli katı LB ortamlarda geliştirilerek iyot buharı ile boyanması sonucunda rekombinant bakterilerde amilaz enzimlerinin aktif olduğu tespit edilmiştir. Her iki enzimin daha çok üretilmeleri IPTG indüksiyonu ile gerçekleştirilmiş ekspresyonu arttırılan rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterilerinden, Ni-NTA kullanılarak α ve β amilaz proteinleri saflaştırılmıştır. Saflaştırılan histidin ile işaretli proteinler SDS-PAGE ve western blot yöntemleri ile tespit edilmiştir. Saflaştırılan rekombinant proteinlerden α amilazın yoğunluğu 4,59 µg/ml ve β amilazın yoğunluğu ise 3,17 µg/ml olarak hesaplanmıştır. Her iki enzimi eşzamanlı aynı bakteride ekspresyonu amacı ile rekombinant BL21/αAmy bakterilerinden kompetan hücreler hazırlanmış ve bu hücrelere rekombinant pETDuet/β plazmidi aktarılmıştır. Her iki rekombinant plazmidin aynı bakteride bulunduğunu doğrulamak için elde edilen kolonilere koloni-PCR testi gerçekleştirilmiş ve kolonilerden bazılarının hem α hem de β amilaz genine sahip olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı eksprese edilen enzimlerden α amilazın 60 kDa, β amilazın ise 55kDa büyüklüğünde olduğu teyit edilmiştir.
Özet (Çeviri)
Thermostable α and β amylase enzymes have been used widely in starch industry and other many fields such as feed, food, paper, textile, leather and detergent manufacturing. These enzymes are produced in little amounts for industrial usage by many hyperthermophilic microorganisms. In this study, thermostable α and β amylase genes were transferred to pET-Duet-1 expression and resulting recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 competent cells by electroporation. Genomic DNA of Bacillus stearothermophilus DSM 22 strain for α amylase and, Thermoanaerobacterium (Clostridium) thermosulfurogenes DSM 2229 strain for β amylase were used as gene sources. Enzymatic activities of recombinant BL21/αAmy and BL21/βAmy bacteria were detected on LB agar with ampicilin and starch and also with staining with iodide steam. The both enzymes were more produced by IPTG induction in recombinant BL21/αAmy and BL21/βAmy bacteria and the recombinant α and β amylase proteins were purified by Ni-NTA agarose column. Histidine labelled both proteins were analyzed by SDS-PAGE and western blot methods. Concentration of the purified proteins were calculated as 4,59 µg/ml for α amylase and 3,17 µg/ml for β amylase. For dual expression of both enzymes, recombinant BL21/αAmy were prepared as competent cells and purified pETDuet/β plasmids were transformed into this cells. Transformed bacteria containing two recombinant plasmids were tested by colony PCR and few colonies were determined comprising both recombinant plasmids. Dual expressed enzymes were analyzed by SDS-PAGE and the molecular mass of the enzymes were confirmed as 60 kDa for α amylase and 55kDa for β amylase.
Benzer Tezler
- Oligotrofik bakteriler yardımıyla düşük maliyetli rekombinant termostabil enzim üretimi
Low-cost recombinant thermostable enzyme production using oligotrophic bacteria
MUSTAFA TANKUŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiSağlık Bilimleri ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ AHMET KATI
- Discovery of novel enzymes using proteomic approaches
Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi
MERVE ÖZTUĞ KILINÇ
Doktora
İngilizce
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ
- Bacillus stearothermophilus var. Calidolactis C953 tan a-galaktosidaz üretimi ile ilgili bir araştırma
Başlık çevirisi yok
E.ESİN HAMEŞ
- Yem katkısı likenaz enzimi üreten bakteri izolasyonu ve enzimin kısmi karakterizasyonu
Isolation of feed additive lichenase producing bacteria and partial characterization of the enzyme
HÜRÜ YÜCEL
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyolojiOsmaniye Korkut Ata ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BAHRİ DEVRİM ÖZCAN
- Yalova üniversitesi mühendislik fakültesi binasının enerji verimliliği'ndeki alternatiflerin araştırılması
Investigation of alternatives in energy efficiency of Yalova university faculty of engineering building
ELİF TAŞTAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
EnerjiYalova ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HALİL ATALAY
PROF. DR. NURDAN YILDIRIM