Geri Dön

Endüstriyel kullanıma uygun, termostabil rekombinant alfa amilaz ve beta amilaz enzimlerinin eş zamanlı bakteriyel ekspresyon ile üretilmesi

Production of recombinant thermostable alpha and beta amylase enzymes via dual expression suitable for industrial usage

  1. Tez No: 398796
  2. Yazar: DİLEK ÖZCAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. HİKMET MURAT SİPAHİOĞLU
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Ziraat, Agriculture
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Yüzüncü Yıl Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 91

Özet

Sıcaklığa dayanıklı amilazlar nişasta endüstrisi başta olmak üzere; gıda, yem, kağıt, tekstil, deri ve deterjan üretimi gibi alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte termostabil amilaz enzimlerinin üretimi, birçok hipertermofilik mikroorganizmada endüstriyel kullanım için düşük miktardadır. Yürütülen bu çalışmada termostabil α ve β amilaz enzimlerinden sorumlu genler spesifik gen kaynaklarından izole edilerek iki farklı klonlama bölgesine sahip pET-Duet-1 ekspresyon vektörüne aktarılmış ve elektroporasyon yöntemi ile Escherichia coli BL21 kompetan hücrelerine transforme edilmiştir. Gen kaynağı olarak, α amilaz geni için Bacillus stearothermophilus DSM 22 ve β amilaz geni için ise Thermoanaerobacterium (Clostridium) thermosulfurogenes DSM 2229 suşlarının genomik DNA'ları kullanılmıştır. Rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterileri nişasta içeren ampisilinli katı LB ortamlarda geliştirilerek iyot buharı ile boyanması sonucunda rekombinant bakterilerde amilaz enzimlerinin aktif olduğu tespit edilmiştir. Her iki enzimin daha çok üretilmeleri IPTG indüksiyonu ile gerçekleştirilmiş ekspresyonu arttırılan rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterilerinden, Ni-NTA kullanılarak α ve β amilaz proteinleri saflaştırılmıştır. Saflaştırılan histidin ile işaretli proteinler SDS-PAGE ve western blot yöntemleri ile tespit edilmiştir. Saflaştırılan rekombinant proteinlerden α amilazın yoğunluğu 4,59 µg/ml ve β amilazın yoğunluğu ise 3,17 µg/ml olarak hesaplanmıştır. Her iki enzimi eşzamanlı aynı bakteride ekspresyonu amacı ile rekombinant BL21/αAmy bakterilerinden kompetan hücreler hazırlanmış ve bu hücrelere rekombinant pETDuet/β plazmidi aktarılmıştır. Her iki rekombinant plazmidin aynı bakteride bulunduğunu doğrulamak için elde edilen kolonilere koloni-PCR testi gerçekleştirilmiş ve kolonilerden bazılarının hem α hem de β amilaz genine sahip olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı eksprese edilen enzimlerden α amilazın 60 kDa, β amilazın ise 55kDa büyüklüğünde olduğu teyit edilmiştir.

Özet (Çeviri)

Thermostable α and β amylase enzymes have been used widely in starch industry and other many fields such as feed, food, paper, textile, leather and detergent manufacturing. These enzymes are produced in little amounts for industrial usage by many hyperthermophilic microorganisms. In this study, thermostable α and β amylase genes were transferred to pET-Duet-1 expression and resulting recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 competent cells by electroporation. Genomic DNA of Bacillus stearothermophilus DSM 22 strain for α amylase and, Thermoanaerobacterium (Clostridium) thermosulfurogenes DSM 2229 strain for β amylase were used as gene sources. Enzymatic activities of recombinant BL21/αAmy and BL21/βAmy bacteria were detected on LB agar with ampicilin and starch and also with staining with iodide steam. The both enzymes were more produced by IPTG induction in recombinant BL21/αAmy and BL21/βAmy bacteria and the recombinant α and β amylase proteins were purified by Ni-NTA agarose column. Histidine labelled both proteins were analyzed by SDS-PAGE and western blot methods. Concentration of the purified proteins were calculated as 4,59 µg/ml for α amylase and 3,17 µg/ml for β amylase. For dual expression of both enzymes, recombinant BL21/αAmy were prepared as competent cells and purified pETDuet/β plasmids were transformed into this cells. Transformed bacteria containing two recombinant plasmids were tested by colony PCR and few colonies were determined comprising both recombinant plasmids. Dual expressed enzymes were analyzed by SDS-PAGE and the molecular mass of the enzymes were confirmed as 60 kDa for α amylase and 55kDa for β amylase.

Benzer Tezler

  1. Oligotrofik bakteriler yardımıyla düşük maliyetli rekombinant termostabil enzim üretimi

    Low-cost recombinant thermostable enzyme production using oligotrophic bacteria

    MUSTAFA TANKUŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyoteknolojiSağlık Bilimleri Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ AHMET KATI

  2. Discovery of novel enzymes using proteomic approaches

    Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi

    MERVE ÖZTUĞ KILINÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ

  3. Bacillus stearothermophilus var. Calidolactis C953 tan a-galaktosidaz üretimi ile ilgili bir araştırma

    Başlık çevirisi yok

    E.ESİN HAMEŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1996

    BiyolojiEge Üniversitesi

    PROF.DR. MÜCAHİT DİZBAY

  4. Yem katkısı likenaz enzimi üreten bakteri izolasyonu ve enzimin kısmi karakterizasyonu

    Isolation of feed additive lichenase producing bacteria and partial characterization of the enzyme

    HÜRÜ YÜCEL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    BiyolojiOsmaniye Korkut Ata Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BAHRİ DEVRİM ÖZCAN

  5. Yalova üniversitesi mühendislik fakültesi binasının enerji verimliliği'ndeki alternatiflerin araştırılması

    Investigation of alternatives in energy efficiency of Yalova university faculty of engineering building

    ELİF TAŞTAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    EnerjiYalova Üniversitesi

    Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HALİL ATALAY

    PROF. DR. NURDAN YILDIRIM