Geri Dön

Development and characterization of monoclonal antibodies against recombinant caga protein and their use in lateral flow test strip for serological diagnosis of Helicobacter pylori infection

Rekombinant caga proteinine karşı monoklonal antikorlar geliştirilmesi, karakterizasyonu ve bunların helıcobacter pylorı enfeksiyonunun serolojik teşhisi için lateral akım test çubuğunda kullanılması

PDF İndir

  1. Tez No: 424359
  2. Yazar: CEBRAİL KARAKUŞ
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. BARİK SALİH
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2016
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Fatih Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 128

Özet

Çoğunlukla gelişmekte olan ülkelerde olmak üzere dünya nüfusunun yaklaşık yarısı Helicobacter pylori ile enfekte olmuştur. Bu bireylerin çoğunluğu asemptomatik olmasına rağmen milyonlarcası mide kanserine ilerleyebilen peptik ülser hastalığı (PÜH) geliştirmektedir. H. pylori enfeksiyonunun teşhisi genellikle hızlı üreaz testi, kültür, PZR ve/veya histopatoloji için mide biyopsilerinin toplanmasına dayanan invazif metotla (endoskopi) yapılmaktadır. H. pylori enfeksiyonu, aynı zamanda ELISA, western blot, lateral akım test çubuğu (LATÇ) ve dışkı antijen testi ile antikorlar veya antijenleri tespit eden invazif olmayan metotlarla teşhis edilebilir. Birkaç virülans faktörün klinik sonucun şiddeti üzerinde bir rol oynadığı bilinmektedir. Bunlar arasında bir immünodominant CagA proteinini kodlayan cagA geni en önemli virülans faktörlerinden biridir. CagA-pozitif suşları en ciddi mukoza lezyonlarına yol açmaktadır ve aynı zamanda PÜH ve mide kanserinin oluşumunda bir risk faktörü olarak rol oynamaktadır. Böyle bir faktörün tespiti, H. pylori enfeksiyonunun teşhisi üzerine önemli bir etkisi olacaktır. Amaçlarımız; daha önce laboratuarımızda geliştirdiğimiz bir rekombinant CagA (rCagA) proteinine karşı hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorlar (Mab'lar) geliştirmek ve her iki rCagA proteini ve anti-rCagA Mab'ları kullanarak CagA-pozitif H. pylori enfeksiyonunun serolojik teşhisi için bir LATÇ geliştirmektir. Bizim 67 kDa rCagA proteinimiz, IPTG ile indüksiyon yapılarak E. coli BL21(DE3) hücrelerinde ekspres edildi ve bu 6xHis-işaretli rCagA protein, denatüre koşul altında bir ticari IMAC kiti kullanılarak saflaştırıldı. Fareler, rCagA antijeni ile aşılandı ve hibridomalar, fare dalak hücreleri ile myeloma hücrelerinin füzyonu ile oluşturuldu. Hibridoma klonlarının taranması sınırlı dilüsyon ile yapıldı ve Mab salgılayan pozitif klonlar, büyük ölçekli üretim için klonlandı. Mab'lar, mevcut bir ticari Protein G afinite kromatografi kiti kullanılarak saflaştırıldı ve SDS-PAGE üzerinde görüntülendi. BS-53, CK-02 ve BS-51 olarak adlandırılan 3 Mab geliştirebildik. Ağır ve hafif zincirleri tespit etmek için bu Mab'lara yapılan izotipleme, bir IgG2b-κ (BS-53), bir IgG2a-κ (CK-02) ve bir IgG2a-κ (BS-51) ortaya çıkardı. Bu Mab'lar, ELISA ve western blot kullanılarak rCagA protein ile tepki verdiler ve ticari Mab'lar ile karşılaştırıldığında benzer reaktiviteler gösterdiler. Bir LATÇ geliştirmek için rCagA ilk olarak altın nanoparçacığa konjuge edildi ve konjugat ped içine yerleştirildi. Konjuge edilmemiş rCagA ve anti-rCagA Mab (CK-02) sırasıyla test çizgisine ve kontrol çizgisine sabitlendi. Bir damla serum örneğinin örnek pedi üzerine eklenmesi, altın ile konjuge edilmiş rCagA'ya bağlanacağı konjugat pede doğru anti-CagA antikorları içeren örnek sıvısının bir lateral akımına sebep oldu. Daha sonra bu kompleks sabitlenmiş rCagA'ya bağlanacağı test çizgisine aktı ve kırmızı bir çizgi ile sonuçlandı. Örnek sıvısının akımı, arta kalan altın ile konjuge edilmiş rCagA'nın sabitlenmiş Mab'a bağlandığı kontrol çizgisine doğru devam etti ve kırmızı bir çizgi oluşturdu. Otuz serum örneği (PZR aracılığıyla bilinen cagA için 22 pozitif ve 8 negatif) LATÇ ile test edildi. Bunların 22 örneğinden 21'i pozitif ve 8 tanesi negatifti. Geliştirdiğimiz LATÇ, anti-CagA antikorlarının tespiti için yüksek bir özgünlük (%100) ve duyarlılık (%95) gösterdi. Sonuç olarak, biz saflaştırılmış ve karakterizasyonu yapılmış 3 Mab geliştirebildik. Bu Mab'lar, ticari olanlara benzer bir şekilde ELISA ve western blot'ın her ikisinde rCagA protein ile reaksiyona girdi. Biz ayrıca zaman alıcı, pahalı ve zahmetli invaziv yaklaşımlar yerine CagA-pozitif H. pylori suşlarının hızlı tespiti için kullanılabilen bir LATÇ geliştirdik. CagA proteininin, hastalığın PÜH ve mide kanserine ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı gastrit hastalarında özellikle olmak üzere H. pylori ile enfekte olmuş hastalarda CagA varlığını belirlemek için bir hayli yardımcı olacaktır. Bu, tüm anti-H. pylori antikorları yerine hasta serumunda anti-CagA antikorlarını tespit eden dünyada ilk LATÇ'dır.

Özet (Çeviri)

Approximately half of the world populations are infected with Helicobacter pylori mainly in the developing countries. The majority of individuals are asymptomatic while millions develop peptic ulcer disease (PUD) that might progress to gastric cancer. The diagnosis of H. pylori infection is mainly done by invasive method (endoscopy) that relies on the collection of gastric biopsies for rapid urease test, culture, PCR and/or histopathology. H. pylori infection can also be diagnosed by non-invasive methods that detect antibodies or antigens by the ELISA, western blot, lateral flow test strip (LFTS) and stool antigen test. Several virulence factors are known to play a role in the severity of the clinical outcome. Among these the cagA gene that encodes an immunodominant CagA protein is one of the most important virulent factors. Strains that are CagA-positive provoke the most severe mucosal lesions and also act as a risk factor for the development of PUD and gastric cancer. The detection of such factor will have an impact on the diagnosis of H. pylori infection. Our aims are to produce monoclonal antibodies (Mabs) by hybridoma technology against a recombinant CagA (rCagA) protein previously developed in our laboratory and to develop a LFTS using both rCagA protein and anti-rCagA Mabs for serological diagnosis of CagA-positive H. pylori infection. Our rCagA protein of 67 kDa was expressed in E. coli BL21(DE3) cells by induction with IPTG and the 6xHis-tagged rCagA protein was purified using a commercial IMAC kit under denaturing condition. Mice were immunized with the rCagA antigen and hybridomas were formed by fusion of mouse spleen cells with the myeloma cells. Screening of hybridoma clones was done by limiting dilution and positive clones secreting Mabs were cloned for large scale production. The Mabs were purified using a commercially available Protein G affinity chromatography kit and visualized on SDS-PAGE. We were able to develop 3 Mabs designated as BS-53, CK-02 and BS-51. Isotyping of these Mabs to detect their heavy and light chains revealed an IgG2b-κ (BS-53), an IgG2a-κ (CK-02) and an IgG2a-κ (BS-51). These Mabs reacted with the rCagA protein using the ELISA and western blot and showed similar reactivities when compared to commercial Mabs. For the development of a LFTS, the rCagA was first conjugated to gold nanoparticle and placed into the conjugate pad. A non-conjugated rCagA and anti-rCagA Mab (CK-02) were immobilized on the test line and on the control line respectively. The addition of a drop of serum sample onto the sample pad lead to a lateral flow of the sample fluid containing anti-CagA antibodies toward the conjugate pad where it bound to the gold conjugated rCagA. The complex then flowed to the test line where it bound to the immobilized rCagA and resulted in a red color line. The flow of the sample fluid continued toward the control line where the remaining gold conjugated rCagA bound to the immobilized Mab and gave a red color line. Thirty serum samples (22 were positive and 8 were negative for cagA by PCR) were tested by the LFTS. Of these 21 out of 22 samples were positive and 8 were negative. Our developed LFTS showed a high specificity (100%) and sensitivity (95%) for the detection of anti-CagA antibodies. In conclusion, we were able to develop 3 Mabs that were purified and characterized. These Mabs reacted with the rCagA protein in both the ELISA and western blot in similar fashion to the commercial ones. We also developed a LFTS that can be used for the rapid detection of CagA-positive H. pylori strains instead of time consuming, expensive and laborious invasive approaches. It will help a great deal to determine the CagA status in H. pylori infected patients particularly those with gastritis since CagA protein plays an important role in the progression of the disease to PUD and gastric cancer in such patients. This is the first LFTS worldwide that detects anti-CagA antibodies in patient sera rather than whole anti-H. pylori antibodies.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    857291

    Development of a novel humanized bioactive monoclonal antibody against HER2

    HER2'ye karşı insanlaştırılmış yeni bioaktif monoklonal antikor geliştirilmesi

    AYBİKE ERDOĞAN ATAY

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Genom Bilimleri ve Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EZGİ KARACA EREK

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  2. Tez No

    510456

    Hastalık belirteci bir proteine karşı monoklonal antikor geliştirilmesi ve karakterizasyonu: Model çalışma

    Development and characterization of monoclonal antibody against A disease marker protein

    ILHAM BAHHAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyoteknolojiTekirdağ Namık Kemal Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEZEN ARAT

    DR. ESİN AKÇAEL

  3. Tez No

    799447

    Vascular function in chronic end-organ damage: pharmacological characterization of vasomotor function in systemic vasculature

    Kronik uç-organ hasarında vasküler fonksiyon: Sistemik damarlarda vazomotor fonksiyonun farmakolojik karakterizasyonu

    NADİR ULU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    Eczacılık ve FarmakolojiUniversity of Groningen (Rijksuniversiteit Groningen)

    Tıbbi Farmakoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ROBERT HENK HENNING

  4. Tez No

    811707

    Synthesis of neuropeptide Y and development of an anti-NPY monoclonal antibody for preclinical treatment of pancreatic cancer

    Nöropeptit y'nin sentezlenmesi ve pankreas kanserinin preklinik tedavisi için anti-NPY monoklonal antikorunun geliştirilmesi

    NURDAN ÇAM

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyokimyaAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi

    Medikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖZGE CAN

  5. Tez No

    479700

    Yeni bir yaklaşımla kuantum nokta esaslı immünofloresan in vitro diagnostik testlerin tasarımı, geliştirilmesi ve biyomedikal uygulamaları

    Design, development and biomedical applications of quantum dot based immunofluorescence in vitro diagnostic tests with a new approach

    ÖZLET AKÇA ÖZDEMİR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    BiyoteknolojiEge Üniversitesi

    Nükleer Bilimler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PERİHAN ÜNAK

    PROF. DR. SUNA TİMUR

Geri Dön