Geri Dön

The development of genetically encoded imaging methods to study redox state and maturation of cytochrome C protein

Cytochrome Cproteininin redoks durumu ve maturasyonunu çalışmak için genetik olarak kodlanabilen görüntüleme metotlarının geliştirilmesi

  1. Tez No: 435841
  2. Yazar: SELEN MANİOĞLU
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. HALİL BAYRAKTAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyofizik, Biyoloji, Kimya, Biophysics, Biology, Chemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2016
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Koç Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 114

Özet

Biyolojik imleşim ve ileri mikroskobik görüntüleme teknikleri için kullanılan genetik olarak şifrelenen floresan habercileri, oksidatif stres altında hücrede gerçekleşen değişim mekanizmalarını açıklamada önemli bir rol oynarlar. Bu sebeple imleşimin görüntülenmesi ve dışarıdan gelen uyarıcıya verilen tepkinin yüksek uzamsal zaman çözünürlüğünde ölçülmesi için sayısal metotlar sağlar. Düşük toksiklik, yüksek imleşim-parazit oranı farklı hücre tiplerinden imleşim alabilme ve kompleks biyolojik yollarda hassasiyet gibi özelliklerinden ötürü bu metodlar çokça tercih edilmektedir. Canlı organizmaların dengeleşimlerini sağlaması ve koruması için redoks mekanizması önemli bir metobolik yoldur. Görevleri arasında enerji üretimi solunum çemberini tamamlamak hücresel redüksiyon özgür radikallerin düzenlenmesi ve apaptoziz başlatılması yer alır. Oksidatif hasar ve dengesiz redoks yayılımı yaşlanma, nörodejaneratif hastalıklar ve hipoksi gibi istenmeyen sonuçlara sebebiyet verebilir. Bu yüzden redoks mekanizmasına dahil ögelerin daha iyi anlaşılması hücre içi imleşim görevi hakkında faydalı bilgileri ortaya çıkarabilir. Redoks aktif demir proteinleri ailesinin bir üyesi olan Cytochrome c (Cyt c), pek çok hücre içi redoks reaksiyonunun gerçekleştiği mitokondrinin iç membranında bulunmaktadır. Asıl görevi, mitokondrinin membranı üzerinden ATP üretiminde yer alan elektron taşıma çemberine elektron transfer etmektir. Bu yüzden Cyt c'nin mitokondrinin redoks mekanizmasındaki kilit rolü, redoks biyogenezini anlamamız için kendisini iyi bir aday olarak öne çıkarmakta ve redoks mekanizması kaynaklı hastalıkların tanısı ve tedavisine ışık tutmaktadır. Bu çalışmada mikrobik proteinlerden arındırılmış Cyt c'nin redoks durumunun görüntülenmesi ve saptanması gösterilmiş, canlı hücrelerde floresan rezonans enerji transferi (FRET) sayesinde Cyt c'nin olgunlaşması ve Cyt c Heme Lyase proteiniyle olan etkileşimi çalışılmıştır. Cyt c'nin oksidasyon durumu fotokromik FRET (pcFRET) metoduyla tespit edilmiştir ki, bu metotta redoks durumuna bağlı olarak değişiklik gösteren Cyt c absorpsiyonu, Cyt c'ye bağlı olan floresan habercisinin emisyonunu modüle etmektedir. Cyt c'nin farklı redoks bileşenleri ile uyarılan sürekli oksidasyon durumu değişimi açıkça gösterilmiştir. Son olarak canlı hücrelerde Cyt c'e heme lyase proteini yardımıyla hemin kofaktörünün yerleştirilmesi, Cyt c'nin katlanması ve redoks proteinleri etkileşimleri tek hücre floresan sinyali izleme metoduyla çalışılmıştır. Aynı zamanda canlı hücrelerden direkt olarak alınan sinyalin karakterizasyonu için her resimde düzeltilmiş florofor katsayısı kullanan orijinal bir FRET izleme metodu raporlanmıştır.

Özet (Çeviri)

Genetically encoded fluorescent reporters for biological signaling and advance microscopy techniques play a key role to elucidate the mechanism of changes in cells under oxidative stress, therefore provide quantitative methods to monitor signaling and measure response to external stimuli at higher spatiotemporal resolution. The use of these methods is highly preferable due to their low toxicity, high signal-to-noise ratio, allowing signal detection from various cell types and specificity for complex biological pathways. Redox mechanism is an essential pathway for living organisms in order to maintain and preserve biological homeostasis. It fulfills the completion of respiratory chain for energy production, cellular reduction, and regulation of free radical species and initiation of apoptosis. Oxidative damage and unbalanced redox propagation can facilitate deleterious situations like aging, neurodegenerative diseases, and hypoxia. Thus, a better understanding of redox mechanism included structures can reveal invaluable information on its interplay in intracellular signaling. Cytochrome c (Cyt c), a member of redox active heme proteins family, is localized in the inner membrane of mitochondria where a great number of intracellular redox reactions take place. Its main function is to transfer electrons across mitochondria's membrane in electron transport chain of adenosine triphosphate (ATP) production. Therefore, the key role of Cyt c in mitochondria's redox mechanism highlights it as a good candidate for advancing our knowledge on the redox biogenesis and lead the way to the diagnosis and treatment of many redox mechanism related diseases. Here, we demonstrated a method for monitoring and determining the redox state of Cyt c in microbial purified proteins and studied the maturation and interaction of Cyt c with Cyt c heme lyase in living cells with fluorescence resonance energy transfer (FRET). The oxidation state of Cyt c was determined through the photochromic FRET (pcFRET) method where the emission of the fluorescent reporter attached to Cyt c was modulated by the redox state driven absorption changes of Cyt c. The continuous changes of Cyt c oxidation state induced by various redox compounds were clearly demonstrated. Finally, we studied the heme lyase induced hemin insertion and folding of Cyt c in living cells and redox protein interactions by using a single-cell fluorescence signal tracking method. We also reported a novel method of frame-by-frame, fluorophore coefficient corrected FRET tracking for the characterization of the retrieved signal coming directly from living cells.

Benzer Tezler

  1. Tracking of intracellular calcium signals for segregation of single-cells

    Tek hücre kümelenmesinde intersellüler kalsiyum sinyallerinin takibi

    MÜGE ATIŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyofizikKoç Üniversitesi

    Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. HALİL BAYRAKTAR

  2. Characterization and fine-tuning of chemogenetic tools for high-resolution multiparametric live-cell imaging using genetically encoded biosensors

    Kemogenetik araçların, genetik kodlanmiş biyosensörler kullanarak, yüksek çözünürlüklü multi-parametrik canlı hücre görüntülemeleri için karakterizasyonu ve optimizasyonu

    YUSUF CEYHUN ERDOĞAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyokimyaSabancı Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. LEVENT ÖZTÜRK

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EMRAH EROĞLU

  3. Development and characterization of osimertinib resistant non-small cell lung cancer cell line models

    Osimertinib dirençli küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücre modellerinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu

    SUDE ERİŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Genom Bilimleri ve Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ŞERİF ŞENTÜRK

  4. Development of a non-animal-based testing method for assessing skin sensitizers using genetically encoded biosensors

    Genetik olarak kodlanmış biyosensörler kullanarak cilt hassaslaştırıcılarının değerlendirilmesine yönelik hayvan esaslı olmayan bir test yönteminin geliştirilmesi

    MELİKE SEÇİLMİŞ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyolojiSabancı Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET SELİM ÇETİNER