Investigation of potential ERK-dependent phosphorylation sites on SIK2
SIK2 üzerindeki ERK'e bağlı olası fosforilasyon bölgelerinin incelenmesi
- Tez No: 459410
- Danışmanlar: PROF. DR. KOYAŞ BUĞRA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2016
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 80
Özet
Laboratuarımızda daha once yapılan çalışmalar, bir serin/treonin kinaz olan SIK2'nin FGF'e bağlı MAPK yolağının negatif regüle eden bir geri-besleme mekanizmasında rol aldığını önermektedir. SIK2'nin FGF2 ile kısa süreli uyarımda Müller hücrelerindeki hızlı aktivite ve treonin fosforilasyon artışının ve in vitro olarak ERK'in SIK2'yi direk olarak fosforlamasının gösterilmiş olması nedeniyle, ERK'in SIK2'nin aktive edici kinazı olduğu düşünülmektedir. Bu çalışma, hipotezimizi destekleyerek, FRS2 ve SOS1'in de SIK2'nin FGF2 stimüle edilen Müller hücrelerinde etkileştiği sinyal kompleksinde bulunduğunu göstermiştir. İkinci aşamada SIK2 üzerindeki ERK'e bağlı potansiyel fosforilasyon bölgelerinin incelenmesi üzerine yoğunlaşılmıştır. Bu amaçla SIK2 üzerindeki olası ERK hedef amino asitleri biyoinformatik yaklaşımla belirlenmiş ve bu aday amino asitler T758 ve T863 in vitro mutagenez yöntemi ile alanine değiştirilmiştir. Deneylerde ERK tarafından gerçekleştirilen fosforilasyonu SIK2'nin otofosforilasyon aktivitesinden ayırabilmek için bu mutasyonları üretirken kinaz inaktif SIK2 kullanılmıştır. HEK 293T hücrelerinde ürettirilen KI-SIK2 ve KI-SIK2'nin mutant versiyonları immünopresipitasyon ile izole edilmiştir. İzole edilen SIK2 örnekleri aktif ERK2 ile birlikte in vitro kinaz deneylerinde kullanılmıştır. Mutant KI-SIK2'ler ile KI-SIK2'nin ERK fosforilasyon düzeyleri arasında önemli bir fark olmadığını göstermiş olan veriler T758 ve T863 amino asitlerinin ERK'in hedef noktaları olmadığına işaret etmekterdir. Olası atipik ERK motiflerinin tanımlanabilmesi amacıyla kütle spektrometirisi analizi de yapılmış, ancak SIK2'nin kapsama seviyesindeki düşüklükten dolayı sonuç alınamamıştır. Bu çalışmalara ek olarak SIK2-Gab1 ilişkisinin daha derinlemesine incelenmesi yolunda ilk adım olarak bu proteinlerin bakteriyel anlatım yapıları da üretilmiştir.
Özet (Çeviri)
The previous studies from our laboratory suggested that the serine/threonine kinase SIK2 is involved in a feedback mechanism downregulating the FGF-dependent MAPK pathway. As it has been shown that the activity of SIK2 is rapidly increasing with concomitant threonine phosphorylation in response to transient FGF2 stimulation in Müller cells and that ERK directly phosphorylates SIK2 in vitro, ERK is proposed to be the activatory kinase of SIK2 in this regulation scheme. This study revealed that FRS2 and SOS1 are also present in the same signaling complex with SIK2 in FGF2 treated Müller cells, supporting our hypothesis. In this study, we focused on the investigation of the potential ERK-dependent phosphorylation sites on SIK2. For this purpose, the two putative ERK target residues T758 and T863 on SIK2 sequence that were identified by bioinformatic analysis were mutated to alanine residues by site-directed mutagenesis. The kinase inactive SIK2 was used for the generation of these mutants to distinguish phosphorylation by ERK from the autophosphorylation activity of SIK2 itself in further assays. KI-SIK2 and the mutant versions of KI-SIK2 were expressed in HEK 293T cells and purified by immunoprecipitation. Purified SIK2 samples were used in in vitro kinase assay with active ERK2. As the mutant forms of KI-SIK2 were phosphorylated at the same level with the KI-SIK2, the results of the in vitro kinase experiment indicated that neither of these threonine residues (T758 and T863) are targeted by ERK2, raising the possibility of non-canonical motifs as ERK targets. Thus, mass spectrometry analysis was also carried out to identify the ERK-dependent phosphorylation sites on SIK2. However, due to low coverage of SIK2 sequence, no informative data was obtained. In the context of this study, as a first step for the further investigation of Gab1-SIK2 interactions, bacterial expression constructs of these proteins were generated.
Benzer Tezler
- Investigation of the effect of valproic acid, an hdac inhibitor, on the relationship between oxidative stress and autophagy in human eosinophil
İnsan eosinofillerinde valproik asit ile oluşturulan oksidatif stres ve otofaji sonrası bağışık yanıtların incelenmesi
GÖKSU ÜZEL TURAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI
- Analysis of candidate cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) genes:Changes in erk phosphorylation in N2A cells
Aday kokain ve amfetamin ile regüle edilen transkript (CART) reseptör genlerinin analizi: N2A hücrelerinde erk fosforilasyonundaki değişimler
AYLA ÖZKILIÇ
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Endokrinoloji ve Metabolizma HastalıklarıOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TÜLİN YANIK
DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON
- Glioblastoma (Gbm) hücre hatları üzerinde multifloral bal ve temozolomid-bal kombine tedavisinin sitotoksik, antimetastatik ve apoptotik potansiyelinin araştırılması
Investigation of the cytotoxic, anti-metastatic and apoptotic potential of multifloral honey and temozolomide-honey combined treatment on glioblastoma (Gbm) cell lines
DENİZ EVRİM KAVAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEFA KIZILDAĞ
DOÇ. DR. SEVGİ İRTEGÜN KANDEMİR
- Betulinik asit'in anti-proliferatif özelliklerinin araştırılması
Investigation of anti-proliferative features of betulinic acid
HÜSEYİN GÜL
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASUMAN DEMİROĞLU ZERGEROĞLU
- Glioma hücrelerinde rosmarinik asitin antikanser moleküler mekanizmalarının araştırılması
Investigation of anticancer molecular mechanisms of rosmarinic acid in glioma cells
ASLIHAN ŞENGELEN
Doktora
Türkçe
2023
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR