Geri Dön

Recombinant human growth hormone production under double promoters by Pichia pastoris

İki promotor kontrolu altında Pichia pastoris ile rekombinant insan büyüme hormonu üretimi

PDF İndir

  1. Tez No: 461935
  2. Yazar: DUYGU YALÇINKAYA
  3. Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Kimya Mühendisliği, Biotechnology, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 289

Özet

Bu yüksek lisans tezinin amacı, metabolik mühendislik tasarımı ve gentik mühendisliği metotlarıyla oluşturulan gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz ve pirüvat dekarboksilaz çift-promotor sistemi altında, Pichia pastoris ile rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) üretimidir. P. pastoris pirüvat dekarboksilaz gen promotoru (PPDC), Saccharomyces cerevisiae α-çiftleşme faktörü prepro sinyal (öncü)-dizini (α-MF1) ile hGH geni içeren DNA parçası, pPDCZαA::hGH plasmitinden çoğaltılmış ve pPIC3.5K ekspreson vektörüne klonlanmıştır. Oluşturulan pPDC3.5Kα::hGH vektörü, pGAPZαA::hGH vektörü ile transfekte edilmiş P. pastoris X-33 suşunun HIS4 lokusuna entegre edilmiştir. Çift-promotor PPDC-PGAP taşıyan r-P. pastoris oluşturulduktan sonra gen kopya sayısı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile belirlenmiştir. PPDC ve PGAP altında birer kopya hGH geni içeren iki rekombinant sistem ile, aynı suşta çift-promotor PPDC-PGAP altında birer kopya hGH geni içeren rekombinant sistem, önceden-belirlenmiş μ_0=0.15 h^(-1) ile hesaplanmış eksponensiyel sürekli besleme akımı Q(t) ile biyoreaktöre beslenen glukozla, çözünmüş oksijen derişimi CDO= %5 değerine set edilen oksijen aktarımı koşullarında, yarı-kesikli pilot-ölçek biyoreaktör deneyleriyle kıyaslanmıştır. Çift-promotor PPDC-PGAP sistemi taşıyan r-P. pastoris rhGH üretim potansiyeli, iki farklı oksijen aktarım koşulunda, CDO = % 5 oksijen-kısıtlamalı ve 15% düşük-oksijen aktarım koşullarında, aynı yarı-kesikli glukoz besleme stratejisi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Deneyler süresince hücre, glukoz, rhGH, organik asit ve etanol derişimleri ölçülmüştür. Oksijen-kısıtlamalı (CDO % 5) koşulda PPDC, PGAP, ve PPDC-PGAP rekombinant-sistemleri altında yapılan üretimlerde salgılanan en yüksek rhGH derişimleri, sırasıyla, 80, 107 ve 179 mg L-1 olarak bulunmuştur. Diğer yandan, çift-promotor PPDC-PGAP ekspresyon sistemi ile CDO % 15'te tutulduğunda, en yüksek rhGH üretimi t=18 st'te 429 mg L-1 'ye ulaşmış ve en yüksek hücre derişimi aynı kalma süresinde 104 g L-1 olarak bulunmuştur. Toplam substrat tüketimi üzerinden ürün ve hücre verimleri ile toplam hücre üretimine göre ürün verimi sırasıyla 0.48 g g-1, 2.12 mg g-1, ve 4.38 mg g-1 olarak hesaplanmıştır. Hücre-içi tepkime hızları (akıları), i) kısıtlamalı-oksijen aktarım koşulunda rhGH üretiminde kullanılan PPDC, PGAP, ile PPDC-PGAP rekombinant-sistemlerini kıyaslamak; ve ii) uygulanan iki oksijen aktarım koşulunun çift-promotor PPDC-PGAP taşıyan r-P. pastoris ekspresyon sistemine etkisini, araştırmak için stokiyometrik kütle-korunum temelli matematik modelle hesaplanmış ve hücre-içi akı dağılımları analiz edilmiştir. Gliseraldehit-3-fosfat ile pirüvat dallanma noktalarındaki metabolik akı dağılımları, ATP oluşum, hücre sentezi, ve rhGH üretim akıları iç-etkileşimleriyle değerlendirilmiştir. Düşük oksijen aktarım koşulunda (CDO= % 15), metabolizmanın solunum yolizinden fermentatif yolizine kaydığı doğrulanmıştır.

Özet (Çeviri)

The aim of the M.Sc. thesis is expression of recombinant human growth hormone (rhGH) by Pichia pastoris under the double-promoters, namely, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and pyruvate decarboxylase, engineered and constructed by metabolic- and genetic- engineering methods. The DNA fragment including the promoter region of the P. pastoris pyruvate decarboxylase (PPDC), Saccharomyces cerevisiae α-mating factor (α-MF1) secretion signal sequence, and hGH gene, was amplified from the pPDCZαA::hGH plasmid and inserted into pPIC3.5K expression vector. Subsequently, the vector pPDC3.5Kα::hGH was transfected into HIS4 locus in r-P. pastoris which was previously transfected by pGAPZαA::hGH vector into GAP locus of the wild-type P. pastoris X-33. Following the construction of the r-P. pastoris carrying the double-promoter PPDC-PGAP, gene copy number of the construct was determined using quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Single copy rhGH expressions under PPDC and PGAP driven expression systems were compared separately with double copies of rhGH production under the double- promoters in pilot-scale bioreactor experiments at limited-oxygen conditions where constant dissolved oxygen (CDO) was kept at 5%, in semi-batch bioreactors with a continuous feed stream designed with pre-determined μ_0=0.15 h^(-1) for glucose feeding. Using the constructed r-P. pastoris carring the double-promoter, two oxygen transfer conditions were designed at constant dissolved oxygen concentrations of CDO = 5% and 15%, which correspond to, respectively, limited and low-oxygen transfer conditions; and the semi-batch fermentations were carried out with continuous glucose feeding designed with the same pre-determined exponential feed flow rate. The cell, glucose, rhGH, organic acid and ethanol concentrations were determined throughout the fermentations. The highest rhGH concentrations in the semi-batch bioreactor operations, secreted under PPDC, PGAP, and PPDC-PGAP at CDO = 5% limited oxygen transfer condition were as 80, 107, and 179 mg L-1, respectively. The highest rhGH production was obtained with the double promoter expression system when CDO was kept at 15% at t=18 h as 429 mg L-1, and the highest cell concentration was attained at t=18 h as 104 g L-1. The overall cell yield on the substrate, overall product yield on substrate, and overall product yield on the cell calculated as 0.48 g g-1, 2.12 mg g-1, and 4.38 mg g-1, respectively. In order to investigate the flux distributions in the intracellular bioreaction network under the three expression systems at limited-oxygen transfer conditions; moreover, the effect of oxygen transfer conditions on the double promoter expression system, metabolic flux analyses were carried out. The flux distributions at the crucial branch points, glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate nodes, and futher the ATP generation and cell synthesis fluxes with rhGH production fluxes were inter-dependently evaluated during fed-batch fermentation processes. The formation of the by-products, ethanol, pyruvic acid, acetic acid, and lactic acid, flux distributions in the pyruvate node supported a shift from respiratory to fermentative metabolism in all experiments owing to low-oxygen availability conditions.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    489447

    Metabolic engineering with a novel promoter in Pichia pastoris for recombinant human growth hormone production: Effects of oxygen transfer conditions

    Rekombinant insan büyüme hormonu üretimi için yeni bir promotor ile Pichia pastoris'te metabolik mühendislik tasarımları: Oksijen aktarım koşullarının etkisi

    ÖZGE KALENDER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  2. Tez No

    338410

    Comparison of human growth hormone production performances of two different metabolically engineered Pichia pastoris

    İki farklı metabolik mühendislik yaklaşımıyla geliştirilen Pichia pastoris hücrelerinin insan büyüme hormonu üretim performanslarının karşılaştırılması

    HALİME GÜL ZERZE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

  3. Tez No

    441947

    Enhanced recombinant human growth hormone production by synchronous populations of two different strains of Pichia pastoris under GAP promoter

    Pichia pastoris'in iki farklı suşunun senkronize popülasyonları ile GAP promotörü altında ınsan büyüme hormonu üretimi

    DAMLA HÜCCETOĞULLARI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  4. Tez No

    201695

    Extracellular recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris

    Pichia pastoris ile hücredışı insan büyüme hormonu üretimi

    MEHMET ALİ ORMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2007

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  5. Tez No

    338078

    Rekombinant insan büyüme hormonunu üretim sistemi ile biyoreaktör işletim koşulları etkileşimi

    Interactions of recombinant human growth hormone production system and bioreactor operation conditions

    ZÜLBİYE ULUŞAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    BiyomühendislikAnkara Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

Geri Dön