Geri Dön

Application of human mesenchymal stem cells to 3D silk fibroin scaffolds for cardiac tissue engineering

İnsan mezenkimal kök hücrelerinin 3B ipek fibroin yapı iskelelerine uygulanarak kardiyak doku mühendisliğinde kullanılması

PDF İndir

  1. Tez No: 467212
  2. Yazar: GİZEM MERVE ŞAHİN
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. FATMA NEŞE KÖK, DR. YÜKSEL ÇETİN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 89

Özet

Ölüm nedenleri arasında kardiyovasküler hastalıklar tüm dünya sıralamasında birinci sıradadır. Kardiyovasküler hastalıklar arasında ise en sıklıkla rastlanan ölüm sebebi kalp krizidir (% 40,5). Kalp krizi sonrası kardiyak hücreler hasar görür ve kendilerini yenileme özelliği olmadığından, bu durum kalp fonksiyonlarında kalıcı hasara neden olur. Bu klinik probleme çözüm bulmak amacı ile β-blokerler, ACE-inhibitörleri, AT1-reseptör blockerleri gibi pek çok farmasötik ilaç kullanılmaktadır. Hastalığın son evresinde ise organ transplantasyonu dışında başka kalıcı bir tedavi yöntemi bulunamamıştır. Bir tıbbi müdahale olarak geçen organ naklinde ise uygun donor bulmak oldukça zordur ve hastanın nakil sonrasında kısa veya uzun vadede organı reddetme olasılığı vardır. Miyokardiyal enfarktüs, daha bilindik adıyla kalp krizi, koroner arterlerde meydana gelen tıkanıklık sonucu kalp kasının ilgili bölümünün oksijensiz kalması ve bunun sonucunda şiddetli göğüs ağrısıyla ortaya çıkan hastalık durumudur. Kalp miyoblast, fibroblast, hücre dışı matris gibi yapılardan oluşmaktadır. Kas hücrelerinin fazlalığı, oksijen miktarındaki düşüklükleri tolere edemeyebilir, bu da kalp krizinin gerçekleştiği kas dokusunda hücre ölümüne neden olur. Kalp hücreleri tam farklılaşmış hücreler olduğundan kendisini yenileme özelliği bulunmamaktadır. Her beş ani ölümden birinin kalp krizi olduğu ve kalp krizinin hastanelere getirdiği ekonomik yük gerçeği ile kalp krizi için doku mühendisliği yaklaşımları umut vadedici araştırma alanıdır. Kardiyak doku mühendisliği yaklaşımı ile temel olarak hastanın kendi kök hücresini 3 boyutlu iskele yapılar ile bir araya getirerek hasarlı dokuyu tedavi etmek amaçlanmaktadır. Bu çalışmada insan adipoz dokusundan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin doğal ve biyobozunur bir polimer olan ipek fibroinden hazırlanmış 3 boyutlu iskelelere ekilerek in vitro koşullarda kardiyak rejenerasyonu amaçlanmıştır. Öncelikle, ipek kozasının içerisindeki serisin proteini uzaklaştırılarak, fibroin proteininin izolasyonu sağlanmıştır. Sonrasında, dondurarak kurutma yöntemi ile üç boyutlu iskele yapılar oluşturulmuştur. Farklı dondurma derecelerinin ve yalıtım levhası kullanılmasının gözenek yapısı üzerindeki etkisi incelenmiştir. Dondurarak kurutma sonrasında metanol işlemi ile fibroin yapısındaki tesadüfi kıvrımların beta-tabaka formuna dönüşmesi sağlanmıştır. Beta-tabaka oluşumunun sağlanması ile daha gözenekli, çözünmesi zor ve kararlı bir yapı elde edilmiştir. Doku iskelelerin karakterizasyonu için morfoloji (taramalı elektron mikroskopu), biyobozunurluk ve su tutma kapasitesi testleri tamamlanmıştır. Değişik ipek fibroin konsantrasyonları (% 1'den % 6'ya) test edilerek, en iyi gözenek yapısına sahip olan iki konsantrasyon (% 2 ve % 4) yalıtım levhası ve metanol etkisinin gözlemlenmesi için seçilmiştir. Dondurma aşamasında yalıtım levhası kullanılması ve ardından metanol işlemi ile, 2 % ve 4 % örnekleri taramalı elektron mikroskopu ile incelenmiştir. Tek yönlü soğutma ve beta-tabaka yapısının artırılmasının gözenek yapısı üzerindeki etkisi belirgin bir şekilde görülmüştür. Su tutma kapasitesini analiz etmek için 2 % ve 4 % örnekler ile devam edilmiştir. Test sonuçlarında silk fibroinin % 1000 gibi yüksek oranlarda su tutma kapasitesine sahip bir polimer olduğu bulunmuştur, ve sonraki deneylerde yapı bütünlüğünün bozulmaması için daha düşük yüzdede su tutma kapasitesine sahip olan (% 4) ipek fibroin iskele yapısı seçilmiştir. Literatürde ipek fibroin proteini için en yüksek bozunurluğu sağlayan proteaz IV enzimi seçilmiştir. Biyobozunurluk hızı 0.1 U/mL proteaz IV enzimi varlığında 14 günlük süre içinde takip edilmiştir. Sonuçlar ipek fibroinin % 50 ağırlığının ilk 10 gün içerisinde bozunduğunu, ve 14. güne kadar bozunmanın daha yavaş hızda devam ettiğini göstermiştir. Ayrıca, ipek fibroinin enzimsiz PBS varlığında inkübasyonu sonucunda, yaklaşık olarak % 25 ağırlık kaybı gözlemlenmiştir. Sonuçlar enzim aktivitesinin biyobozunurlukta önemli bir yol olduğunu doğrulamıştır. Çalışmanın ikinci kısmında, Medeniyet Üniversitesi Göztepe Eğitim ve Araştırma Hastanesinden alınan etik kurul raporuna uygun olarak, 40 ve 50 yaş aralığında kadın hastalardan liposuction operasyon sonrası elde edilen yağlardan mezenkimal kök hücreler izole edilmiştir. Adipoz doku, doku mühendisliğinde sıklıkla tercih edilen bir hücre kaynağı olmasa da, tek bir operasyonda fazla sayıda ve kolaylıkla elde edilmesi, birden fazla hücreye farklılaşabilmesi nedeni ile seçilmiştir. Ayrıca kemik iliğinden ve embriyodan alınan kök hücrelere göre etik kaygılar daha azdır. Adipoz dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin karakterizasyonu akış sitometri ve immunohistokimya yöntemleri ile yapılmıştır. Akış sitometri yöntemi öncesinde, literatürde ve Uluslararası Kök Hücre Kurumu tarafından belirtilmiş olan mezenkimal kök hücre belirteçlerine göre, izole edilen hücreler CD44, Anti-human-CD166, CD73, CD105, CD90, CD13, CD45, Anti-HLA-DR, CD15, CD34, CD19, CD11b, CD 14, CD45 karakterize edilmiştir. Akış sitometri ile, adipoz dokudan izole edilen hücreler yüksek saflıkta, % 90' ın üzerinde mezenkimal kök hücre olarak karakterize edilmiştir. İkincil kriter olarak, kök hücrelerin üç farklı hücre tipine dönüşmesi potansiyeli test edilmiştir. İmmunohistokimya analizinde adipoz dokudan alınan mezenkimal kök hücrelerin farklı boyama teknikleri ile adiposit, kondrosit ve osteositlere dönüştüğü gösterilmiştir. Kök hücreler sırası ile 14, 21, 21 gün farklılaşma ortamında kültür edildikten sonra, kondrosit, osteosit ve adiposit hücrelere dönüştüğü gözlemlenmiştir. Farklılaşmanın karakterizasyonu için kondrojenik hücrelerde Alcian Blue boya, osteojenik hücrelerde Alizerin Red boya ve adipojenik hücrelerde Oil red O boyası kullanılmış ve anlamlı boyama elde edilmiştir. Daha sonra, mezenkimal kök hücre olarak karakterize edilen hücrelere bir gün süre ile 5-azacytidine, 20 gün süre ile ise geliştirilmiş kardiyak farklılaştırma kültür ortamı sağlanmıştır. Hücrelerin morfolojisinde değişim görülse de, kardiyomiyosit benzeri yapılar görülmemiş ve kardiyak özel belirteçler ile anlamlı boyama sonucu elde edilememiştir. Kardiyomiyosit hücrelere farklılaştırma sürecinin ikinci adımında PSC kardiyomiyosit farklılaşma kiti kullanılmış ve kardiyomiyositlere dönüşüm gerçekleşmiştir. 10 günlük inkübasyon sonunda sarkomerik ve top şeklinde yapılar mikroskopla gözlemlenmiş, α-actinin, Troponin I, Connexin 43 ve Myosin ağır zincir kardiyak belirteçleri ile pozitif boyanmıştır. Doğal polimer olan ipek fibroinin biyouyumluluğuna ve hücre canlılığına etkisi, MTT, WST-1 ve Live/Dead testleri ile incelenmiştir. Hücre çoğalması kolorimetrik bir yöntem olan MTT testi ile ölçülmüştür. Sonuçlara göre, hücre sayısında 1. günden 14. güne doğru artış gözlemlenmiş, ipek fibroin iskele yapı üzerinde hücre canlılığı 1., 7., ve 14. günlerde sırası ile % 90, % 118 ve % 138 olarak belirlenmiştir. Bu sonuçlar bize, hazırlanan ipek fibroin iskelelerin güvenilir, biyobozunur bir biyomateryal olarak doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabileceğini kanıtlamıştır. Standart bir tıbbi cihaz biyouyumluluk testi olarak WST-1 direkt ve indirekt testleri uygulanmıştır. Her iki test sonucunda, ipek fibroinin kontrol grubuna göre hücre çoğalması sırası ile % 92 ve % 104 bulunmuştur. Özetle, ipek fibroin kardiyak doku mühendisliği uygulamalarında biyobozunur, biyouyumlu ve çekme direnci özelliklerinden dolayı tercih edilebilir bir biyomateryal olduğu bulunmuştur. Ayrıca, adipoz dokunun izolasyonu, karakterizasyonu ve farklılaştırılmasının sağlanması kardiyak uygulamalarda alternatif hücre kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Adipoz dokudan elde edilen kök hücrelerin kardiyak hücrelere dönüştürülerek bağışıklık tepkisi yaratmayan biyobozunur ve biyouyumlu 3 boyutlu iskele yapı oluşturulması gelecekteki çalışmalar için umut vericidir. Bunlara ek olarak, adipoz dokudan gelen mezenkimal kök hücreler kardiyomiyosit hücreler ile birlikte kültür edilebilir. Ayrıca, ipek fibroin iskele yapısı başka doğal veya sentetik polimerlerle komposit yapı oluşturarak geliştirilebilir. Elde edilen 3 boyutlu iskele yapı gerçek doku ortamına benzeyen biyoreaktörde test edilebilir. Sonuç olarak, kardiyak farklılaşmanın tam anlamıyla sağlanabilmesi ve biyouyumlu komposit yapıyla test edilmesi için daha kapsamlı çalışma gerekmektedir.

Özet (Çeviri)

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world. The risk of getting myocardial infarction (MI) is the highest rate (40.3 %) of deaths caused by cardiovascular diseases. MI causes loss of cardiomyocytes which lead to decrease in heart function. Since the regenerative capacity of cardiomyocytes is extremely low, the damage becomes permanent in many patients. There are many treatments for this clinical problem such as using β-blockers, and ACE-inhibitors, AT1-receptor blockers, or organ transplantation at the later stage, but the number of patients with MI is increasing and current treatments are not effective enough to resolve this problem. At this point, development of the replacement tissue to replace or repair damaged area by tissue engineering techniques using patient's own cells on scaffolds has been explored as a lifesaving approach. In this study, human adipose-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSCs) and silk fibroin, a natural, biodegradable and biocompatible polymer, was chosen to regenerate damaged cardiac tissue after MI. 3D silk scaffolds were fabricated by the freeze-drying method, and effect of freezing conditions and insulation cover on pore structure was evaluated. After freeze drying process, silk scaffolds were exposed to methanol treatment to induce beta sheet structure from random coil structure which is also related to pore structure. Then, scaffolds were characterized for their water uptake capacity, morphology (scanning electron microscope (SEM)), biodegradation, and for their potential to sustain cell viability and proliferation tests. SEM results showed the change of pore structure by changing the ratio of silk fibroin in the solution. According to results, the best two ratios in terms of pore structure, 2 %, and 4 %, were chosen for next steps. Water uptake test showed high fluid uptake capacity of those silk fibroin scaffolds. To prevent an excessive change in scaffold structure during application, the scaffold with lower water uptake ratio was selected. Biodegradation test was performed for 14 days with 0.1 U/mL Protease IV to determine the biodegradation rate of scaffolds which is an essential parameter in tissue engineering. Silk fibroin scaffolds were degraded to about 50 % of their initial weight on day three, then biodegradation rate slowed down. After the characterization of the scaffolds, mesenchymal stem cells were isolated from human adipose tissue which is a rare cell source for cardiac tissue engineering. hAD-MSCs are selected because of its ease of collection and high amount of cell obtained from a single operation. After the isolation procedure, characterization of mesenchymal stem cells was done with flow cytometry and immunohistochemistry analysis. Flow cytometry results showed that more than 90 % of the culture was characterized as MSC, indeed with a high level of purity, and immunohistochemistry analysis proved the multi-differentiation capacity of hAD-MSCs into three different cell types; osteocytes, chondrocytes, and adipocytes. Later, isolated and characterized hAD-MSCs were differentiated into cardiomyocytes with PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit to seed on silk scaffolds. Sarcomeric, ball-like structure was seen under an inverted microscope, and differentiation of hAD-MSCs was proven with cardiac-specific markers such as α-actinin, Troponin I, Connexin 43, and Myosin heavy chain by immunofluorescence analysis. Ultimately, the biocompatibility of silk fibroin is needed to be proven as an implantable biomaterial with cell viability and cell proliferation tests. Thus, Live/Dead, and MTT analysis were performed at 1, 7, and 14 days of incubation of hAD-MSCs on scaffolds. Live/Dead images showed that density of the viable cells were increased as time passed. Moreover, the percentage of cell proliferation of hAD-MSCs on the day of 1, 7, and 14 days were found as 90 %, 118 %, and 138 %, respectively. This finding showed that the silk fibroin scaffolds can support cell proliferation and viability. In conclusion, this study showed that fabricated silk fibroin scaffolds are biodegradable, biocompatible systems to be used in cardiac tissue engineering. Despite hAD-MSCs are not common cell source for cardiac therapies, it can be an alternative source for future studies since its isolation, characterization, and differentiation was happened as expected. The combination of silk fibroin scaffolds with hAD-MSCs can be a promising approach for future studies.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    474880

    Influence of microenvironment on tissue engineering applications

    Mikroçevrenin doku mühendisliği uygulamalarına etkisi

    ESEN SAYIN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. VASIF NEJAT HASIRCI

    DOÇ. DR. ERKAN TÜRKER BARAN

  2. Tez No

    372762

    Biyofiziksel ve biyokimyasal uyaranlarla desteklenmiş doku iskeleleri ile mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının incelenmesi

    Investigation of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells with scaffolds supported by biophysical and biochemical stimulants

    ANIL SERA ÇAKMAK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    BiyomühendislikHacettepe Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU

  3. Tez No

    338118

    Adipoz mezenkimal kök hücrelerin damar düz kas hücrelerine farklılaştırılması ve damar doku mühendisliğinde kullanımı

    Differentiation of adipose mesenchymal stem cells to vascular smooth muscle cells and their use in vascular tissue engineering

    YAVUZ EMRE ARSLAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    BiyokimyaAnkara Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. YAŞAR MURAT ELÇİN

  4. Tez No

    684387

    Üç boyutlu biyobaskı teknolojisinin yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler üzerindeki oksidatif strese etkisi

    The effect of three dimensional bioprinting technology on oxidative stress of adipose-derived mesenchymal stem cells

    DAMLA ALKAYA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyolojiAnkara Üniversitesi

    Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AÇELYA YILMAZER AKTUNA

  5. Tez No

    744792

    Effects of integrin binding peptides andlow level laser therapy on scaffold free vascularized bone microtissue regeneration

    İntegrin bağlayıcı peptidlerin ve düşük seviyeli lazer terapisinin doku iskelesiz vaskülerize kemik mikrodoku rejenerasyonuna etkisi

    ZİYŞAN BUSE ÇEVİK

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyomühendislikİzmir Katip Çelebi Üniversitesi

    Biyomedikal Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. OZAN KARAMAN

Geri Dön