Geri Dön

Investigating the behavior of endothelial cells and monocytes under disturbed flow conditions within a microfluidic system

Mikroakışkan sistemde düzensiz akış durumunda endotel ve monosit hücre davranışlarının incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 467243
  2. Yazar: RANA FUÇUCUOĞLU
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Bilim ve Teknoloji, Biyoloji, Genetik, Science and Technology, Biology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 99

Özet

Hücreler, çevreleri tarafından uygulanan mekanik kuvvetleri algılama ve bu kuvvetlere yanıt verme yeteneğine sahiptir. Fiziksel uyaranların algılanmasının ardından sinyal, mekanotransdüksiyon adı verilen bir süreç ile hücre içine iletilerek biyolojik aktiviteye çevirilir. Mekanik sinyaller biyokimyasal sinyaller ile birleşerek bir hücre içinde birçok yanıt oluşturur. Mekanik işaretlere karşı birçok hücrenin verdiği ortak yanıtlar ile oluşan regulasyonlar önemli doku fonksiyonlarını gerçekleştirmektedir. Mekanik kuvvetlerin fizyolojik düzenindeki bozukluklar anormal hücre davranışlarına ve hastalığa sebebiyet verebilir. Özellikle kan damarlarının işleyişi mekanik uyarılma yolu ile düzenlenmektedir. Atardamar, toplardamar ve kılcal damarların iç yüzeyini kaplayan endotel hücreler kan akışı sonucu oluşan hemodinamik kuvvetler nedeniyle devamlı olarak gerilmeye maruz kalmaktadır. Endotel hücrelerin aldığı mekanik sinyallerde sıklıkla değişimler meydana gelmektedir. Endotel tabakası, kan akışı ve altta bulunan vasküler doku arasında bir köprü ve bir bariyer işlevi görür. Buna bağlı olarak endoteldeki mekanik sinyalleşme, çoğunlukla nitrik oksit üretimi ile damar genişliğinin regulasyonu üzerinden damar sürekliliğini sağlamaktadır. Endotel hücrelere etkiyen mekanik kuvvetler arasında en çok çalışılan kuvvet, akışın sebep olduğu paralel sürtünme kuvveti olan kayma gerilmesidir. Kayma gerilmesi üzerine yapılan çalışmalar, bu kuvvetin endotel bariyerini düzenlemede ve vasküler hastalıkları önlemede başlıca bir rolü olduğunu göstermiştir. Hemodinamik kayma gerilmelerinin düzeni, damar hasarında ya da çatal yerleri ve kıvrılma noktaları gibi dallanma görülen damar geometrilerinde bozulmaktadır. Laminer kan akışı dallanma noktalarında düzensizleşmekte ve salınımlı ya da geriye dönük ikincil akışlara ayrılmaktadır. Bu durum dallanma bölgelerinde düşük kayma gerilmesi bölgeleri oluşturmaktadır. Mekanobiyoloji, mekanik kuvvetlerin hücre fonksiyonlarını nasıl etkilediğini araştıran disiplindir. Üç boyutlu damar mikroçevresini ve sıvı akışını oluşturmak gerektiği için vasküler mekanobiyolojiyi çalışmak özellikle zorlayıcı bir hale gelmektedir. Bu şekilde bir ortam oluşturabilmek için günümüzde mikroakışkan kanallar kullanılmaktadır. Özgün kanal geometrilerine sahip mikro boyutlu cihazlarda endotel hücrelerin kültürünün yapılması ile kontrollü kayma gerilmesi ortamında hücre davranışları çalışılabilmektedir. Arterlerde plak oluşumu hastalığı olan ateroskleroz, bölgesel kayma gerilmesi değişimleri ile ilişkilendirilen yaygın bir hastalık olduğu için bu alanda dikkat çeken bir araştırma konusu olmuştur. Hücre iskeleti mekanotransdüksiyon sürecinin merkezinde bulunur. Hücre iskeletinin bileşenleri birbirleriyle ve hücre zarı proteinleri ile bağlantılıdır ve bu sayede gerilme kuvvetlerinin dengesini ve iletimini sağlamaktadır. Kayma gerilmesi kuvveti ilk olarak hücre yüzeyinde deformasyon oluşturur ve membran iyon kanallarını aktifleştirir. Hücre iskeleti, sinyalin ikincil mesajcılar aracılığıyla iletimine yardımcı olur. Ardından, mesaj biyokimyasal aktiviteye çevirilerek hücrenin uzak bölgelerine iletilir ve bu süreçte sinyal yolaklarını aktifleştirerek gen transkripsiyonunu veya hücrenin adezyon etkileşimlerini düzenler. Laminar kayma gerilmesine maruz kalan endotel hücreleri akış yönünde uzama ve hizalanma davranışı gösterir. Düşük kayma gerilmesinin bir endotel hücre adezyon molekülü olan ICAM-1 (hücreler arası adezyon molekülü-1) ifadesinde artışa neden olduğu ve bu sayede endotel tabakasının lökositlere karşı geçirgenliğini arttırdığı gösterilmiştir. İnsan aortalarında yapılan çalışmalar ise kayma gerilmesinde düzensizlik gösteren damar çatallarının dış duvarlarının endotel tabakasında fazlaca monosit birikmesi olduğunu göstermiştir. Monositler bakteri, virüs ve zararlı metabolitlerin uzaklaştırılması görevini üstlenen fagositik doğal bağışıklık hücreleridir. Kanda dolaşım halinde bulunan monositler, homeostazi ya da enflamasyonda görev almak üzere diyapedez ile dokulara geçerek temelde makrofaja farklılaşır ve fagositoz ve antijen sunumu işlevlerini gerçekleştirirler. Ateroskleroz gibi doku hasarına neden olan uzun süreli enflamasyonlarda monositler merkezi bir rol oynamaktadır. Ateroskleroz, endotel hasarına karşı yağ yüklü plak oluşumu ile karakterize edilen bir kronik enflamatuar yanıttır. Aterosklerotik plakların gelişimi ve ileri aşamalarda patlaması kardiyovasküler hastalıklara sebebiyet verir. Ateroskleroz oluşumu biyokimyasal risk faktörlerinin varlığının yanında lokal kan akışının tipine de bağlıdır. Düz damarlardaki yüksek laminar kayma gerilmesi ateroskleroza karşı koruyucu iken, salınımlı/tersinir kan akışı görülen kıvrılan damar geometrilerindeki düşük kayma gerilmesi ateroskleroza eğilimli bölgeler oluşturur. Ayrıca, plak geliştikçe damar çapı küçülerek kan damarı daralmakta ve lokal kayma gerilmesini değişime uğratmaktadır. Fizyolojik kayma gerilmesinin önemi ve endotel hücrelerin kayma gerilmesindeki değişimlere verdiği yanıtlar üzerine birçok çalışma yapılmıştır. Ancak şimdiye kadar hiçbir çalışma düzensiz akışın endotel hücreler üzerindeki biyolojik etkilerini, aterosklerotik plak mikroçevresini yüksekten düşüğe kayma gerilmesi değişimi yönünden taklit eden bir model kullanarak incelememiştir. Bu çalışmada, aterosklerotik plak geometrisini taklit eden özgün tasarımlı bir kaviteli mikrokanal kullanılarak düzensiz akışın HUVEC hücreleri (göbek kordon ven endotel hücreleri) üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Çalışmanın ilk bölümünde, düz ve kaviteli kanallarda konflüent endotel tabakası elde etme ve hücreler üzerine kayma gerilmesi uygulama metodları anlatılmıştır. Yapılan ön çalışmalarda, düzensiz kayma gerilmesinin endotel hücrelerinin F-aktin ağı ve ICAM-1 molekül ifadesi üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Düşük seviyedeki düzensiz kayma gerilmesinin hücre korteksinde F-aktin birikimine ve akış yönünde F-aktin yapılanmasına yol açtığı belirlenmiştir. Bu etkinin, kanalın göreceli yüksek kayma gerilmesine sahip olan dar bölgelerinde daha fazla bulunduğu tespit edilmiştir. HUVEC hücrelerinin göreceli düşük kayma gerilmesi uygulanan kavite bölgelerinde daha rastgele olarak hizalanması, bu bölgelerdeki akışın lokal olarak düzensizleşmesi ile ilişkilendirilebilir. Ayrıca, düşük seviyeli düzensiz kayma gerilmesinin ICAM-1 mRNA ifadesini arttırdığı belirlenmiştir; fakat TNFα aktivasyonu ile karşılaştırıldığında, düzensiz kayma gerilmesinin sebep olduğu ICAM-1 artışı daha düşüktür. Sonuç olarak, ateroskleroza eğilimli bölgelerdeki düzensiz kayma gerilmesi endotel adezyon molekülü ICAM-1 ifadesinin arttırılması yoluyla monosit hücrelerinin endotele çağırılmasına katkıda bulunuyor ve bu etki TNFα varlığı ile güçlendiriliyor olabilir. Bu çalışmada referans olarak yalnızca statik hücreler ele alınmıştır; fakat ilerideki çalışmalar için endotel hücrelere düz kanallarda laminar kayma gerilmesi uygulanacak şekilde ek kontrol grupları dahil edilebilir. Kayma gerilmesinin monosit davranışı üzerindeki tekil etkisi günümüze dek çalışılmamıştır. Bu çalışmada, THP-1 hücreleri kaviteli mikrokanallarda ardışık yüksek ve düşük kayma gerilmelerine maruz bırakılmış (ortalama olarak 4 Pa normal, 15 Pa yüksek, 45 Pa çok yüksek) ve F-aktin seviyesi floresan mikroskopi ve akan hücre ölçer yöntemleri ile araştırılmıştır. Yüksek seviyeli (15 Pa) düzensiz kayma gerilmesinin THP-1 monosit hücrelerinde F-aktin miktarını arttırdığı belirlenmiştir. Çok yüksek (45 Pa) seviyeli düzensiz kayma gerilmesinin THP-1 monosit hücrelerinde uzun vadede F-aktin miktarını azalttığı sonucuna varılmıştır. Bunların yanında, düzensiz kayma gerilmesi etkisinin kısa zaman aralıklarında belirlenerek etkinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasının sağlanabileceği düşünülmektedir.

Özet (Çeviri)

Cells are capable of sensing and responding to the mechanical forces exerted by their environment. Reception of physical stimuli is followed by transmission and conversion of the signal into biological activity in a process defined as mechanotransduction. Mechanical signals combine with biochemical signals to produce multiple responses within a cell. Cumulative regulation in response to mechanical cues by a population of cells in close proximity can maintain important tissue functions. Disturbance in physiological patterns of mechanical forces may lead to abnormalities and disease. Blood vessels are particularly regulated via mechanical stimulation. Endothelial cells that line arterial, venular and capillary inner walls are under continuous strain by the hemodynamic forces as a result of blood flow. Alterations in the mechanical signals received by endothelial cells are frequent. The endothelium provides a bridge and a barrier between the bloodstream and the underlying vascular tissue. Consequently, mechanical signaling at the endothelium has an influence on overall vascular maintenance; mostly regulating the level of vessel dilation via the production of nitric oxide. The most studied mechanical force on endothelial cells is shear stress, the parallel frictional force caused by the flow of a fluid. Studies on shear stress have revealed that it has a major role in maintaining endothelial barrier and in preventing vascular diseases. Hemodynamic shear stress have a regular pattern that can locally variate in case of a damaged vessel, or in sites of branching geometries such as bifurcations and curvatures. In the branching geometries, laminar blood flow is disrupted and separated into secondary flows of oscillatory or reversing behavior, creating low shear stress in the local area. Mechanobiology is the discipline that studies how mechanical forces can affect cellular functions. Studying vascular mechanobiology is particularly challenging in that it requires establishment of the three-dimensional vascular microenvironment and generation of fluid flow. Recently, microfluidic channels have come into use to enable creating such research environments. Culturing of endothelial cells in microdevices of unique channel geometries allows to study cell behavior under controlled shear environments. Atherosclerosis, formation of fatty plaques in arteries, draws much attention because it is a common disease that has been linked to local alterations in shear stress. The cytoskeleton is at the core of mechanotransduction. Elements of the cytoskeleton are connected to each other and to membrane proteins, providing the balance and transmission of tensional forces. The shearing force initially deforms the cell surface and activates membrane ion channels, followed by transmission of the signal by secondary messengers assisted by the cytoskeleton. Then the message is converted into biochemical activity and is carried to distant regions of the cell. Transduction of the signal activates intracellular signaling pathways to promote gene transcription or regulates cell adhesion interactions. Upon exposure to laminar shear stress, endothelial cells elongate and align their cytoskeleton in the direction of flow. Low shear stress has been shown to increase the expression of endothelial adhesion molecule ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), promoting endothelial permeability to leukocytes. Studies on human aortas suggest that monocytes accumulate greatly at the endothelium in the outer walls of bifurcations that are susceptible to disturbed shear stress patterns. Monocytes are phagocytic innate immune cells that remove bacteria, viruses and toxic metabolites. Monocytes circulate in the bloodstream, but they enter tissues via diapedesis and differentiate into macrophages in order to participate in homeostasis or inflammation via phagocytosis and antigen presentation. Monocytes play a central role in long-term, tissue-damaging inflammatory conditions such as atherosclerosis. Atherosclerosis is a chronic inflammatory response to endothelial injury characterized by formation of fat-laden plaques in artery walls. Progression and perchance rupture of atherosclerotic plaques can lead to cardiovascular disease. The occurrence of atherosclerosis depends on the nature of local blood flow as well as the presence of biochemical risk factors. While high laminar shear stress in straight blood vessels is atheroprotective, low shear stress and oscillatory/reversing blood flow in vessel curvatures bring about atheroprone sites. In addition, the blood vessel becomes narrower as the atherosclerotic plaque grows, changing the local shear stress at the plaque site. The significance of physiological shear stress and the response of endothelial cells to alterations in shear stress have been well studied to date. However, no studies yet have analyzed the biological effects of disturbed flow on endothelial cells applying a model that can mimic the atherosclerotic plaque microenvironment with high-to-low alteration of shear stress. In this study, a unique design of cavitated microfluidic channel mimicking the atherosclerotic plaque geometry was used for the first time to study the effects of disturbed flow on HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells). The first part of the study describes methods to obtain a confluent endothelial monolayer within straight and cavitated microfluidic channels and a method to apply shear stress on cells. In the preliminary studies, disturbed shear effects on endothelial F-actin network and ICAM-1 expression were investigated. Low-level disturbed shear stress was shown to cause F-actin accumulation at the cell cortex and F-actin reorganization in the direction of flow. This effect was higher in the narrower channel regions where shear stress was relatively high. The more random alignment of HUVECs in the low shear-harboring cavities may be related to the local disturbance of flow within the region. In addition, low-level disturbed shear stress was found to upregulate ICAM-1 mRNA expression, although a less increase in the expression was obtained when compared to TNFα activation. Taken together, disturbed shear stress at atheroprone regions may contribute to monocyte recruitment at the endothelium via upregulation of the endothelial adhesion molecule ICAM-1, driving the effect further with local presence of TNFα. Since this study involved only static cells as a reference, further studies may include application of laminar shear stress on endothelial cells in straight channels as an additional control. The individual effect of shear stress on monocyte behavior has not been studied to date. In this study, THP-1 monocytic cells were subjected to sequential high and low shear stress in cavitated channels at an average of 4 Pa as normal, 15 Pa as high or 45 Pa as very high shear stress and changes in F-actin levels were analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry. High level (15 Pa) disturbed shear stress was determined to increase F-actin content, whereas very high (45 Pa) level of disturbed shear stress was concluded to decrease the F-actin content in the long term in THP-1 monocytes. Furthermore, the effect of disturbed shear on F-actin in shorter time intervals may be assessed to fully characterize time-dependent changes in the F-actin.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    539985

    Investigation on the effects of mechanical forces on endothelial and monocytic cell behaviour by using microfluidic systems

    Mikroakışkan sistemler kullanılarak mekanik kuvvetlerin endotel ve monosit hücre davranışı üzerine etkilerinin incelenmesi

    SEMRA ZUHAL BİROL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Bilim ve Teknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. LEVENT TRABZON

  2. Tez No

    769587

    Investigating the effects of collagen fibril alignments on hepatocellular carcinoma cells

    Kolajen fibril hizalanmasının hepatoselüler karsinom hücreleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi

    SELİN OKTAY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyomühendislikİzmir Ekonomi Üniversitesi

    Biyomühendislik Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ BURÇAK ALP

    DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHANGİR YANDIM

  3. Tez No

    522622

    Sferoid yüklü ECM--mimetik peptit amfifil hidrojellerle çip-üstü-karaciğer geliştirilmesi

    Development of liver-on-chip with spheroid loaded ECM--mimetic peptide amphiphile hydrogels

    ŞEYMA BEKTAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyomühendislikHacettepe Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU

  4. Tez No

    695607

    İlaç araştırmaları için 3-boyutlu mikroakışkan damar modelinin geliştirilmesi

    Development of 3-dimensional microfluidic vessel model for drug testing

    BURAK İPEK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyomühendislikHacettepe Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM

  5. Tez No

    271623

    Statinlerin koroner bypass cerrahisi sonrası postoperatif sonuçlara etkisi ve pleiotropik etkilerinin araştırılması

    The effects of statins on postoperative outcomes after coronary bypass surgery and investigating the pleiotropic effects

    ÇAĞDAŞ BARAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Göğüs Kalp ve Damar CerrahisiAnkara Üniversitesi

    Kalp ve Damar Cerrahisi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÜMİT ÖZYURDA

Geri Dön