Investigation on the effects of mechanical forces on endothelial and monocytic cell behaviour by using microfluidic systems
Mikroakışkan sistemler kullanılarak mekanik kuvvetlerin endotel ve monosit hücre davranışı üzerine etkilerinin incelenmesi
- Tez No: 539985
- Danışmanlar: PROF. DR. LEVENT TRABZON
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Bilim ve Teknoloji, Biyoloji, Makine Mühendisliği, Science and Technology, Biology, Mechanical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 125
Özet
İnsan fizyolojisinde, hücrelerin sadece biyokimyasal işaretleri değil aynı zamanda hücre ve doku işlevselliği üzerinde önemli rol oynayan mekanik kuvvetler, geometri ve matriks esnekliği gibi fiziksel faktörleri de algılayabildiği de bilinmektedir. Mekanobiyoloji, mekanotransdüksiyon süreciyle bu fiziksel faktörlerin temel olarak görev yaptığı çalışma alanıdır. Mekanotransdüksiyon, mekanik kuvvetleri ve bu kuvvetlerin elektriksel ve biyokimyasal sinyallere dönüştürülmesini algılamak için gerekli olan fizyolojik bir süreçtir. Mekanotransdüksiyon sürecinde önemli rol oynayan hücre membranı, hücre ile dış ortam ya da komşu hücreler arasında arayüz oluşturur ve meydana gelen genel doku deformasyonu sebebiyle hücreler mekanik stresi membran aracılığıyla çoğunlukla gerilme ya da sıkışma şeklinde algılar. Sıkışma, gerilme ve kan akışı ile oluşan kayma gerilmesi vücutta hücre üzerine etki eden mekanik uyaranlardan en önemlileridir. Bu mekanik uyaranlar, farklı elektrofizyolojik ve biyokimyasal cevapları tetikleyerek doku dengesinin devamlılığını sağlayabilmek için gerekli olan gen ifadesi, protein sentezi, hücre büyümesi, farklılaşması ve ölümü gibi hücresel işlevlerinin düzenlenmesinde temel rol oynamaktadır. Hücre düzeyinde, hücre dışı ortamı algılama ve bu ortama verilen yanıttan oluşan çekim kuvvetleri yara iyileşmesi, anjiyogenez ve metastaz gibi birçok biyolojik süreci etkileyebilmektedir. Bu nedenle bu mekanik kuvvetlerin büyüklük ve doğrultu açısından karakterizasyonu, doku ve organ düzeyinde fizyolojik ve patolojik olayları tahmin etme ve anlamada faydalı olabilir. Doku ve organ düzeyinde, fizyolojik olayların sürdürülmesinde büyük oranda etkisi olan ve kanda birim alana düşen sürtünme kuvveti olarak tanımlanan kayma gerilmesi, damarların iç yüzünü döşeyen endotel hücrelerinin üzerinde gelişim ve fizyoloji açısından çok büyük öneme sahiptir. Bu kayma gerilmesi, bir borunun çapraz kesitinde meydana gelen akış hızı değişimiyle ilişkilidir. Hız merkezde en fazlayken duvara yakın yerde sıfırdır. Merkezden damar duvarına bir dik indirildiğinde, en yüksek kayma gerilmesi kuvvetinin damar duvarı üzerine etki ettiği görülmektedir. Kayma gerilmesine verilen biyolojik cevapların vasküler hastalıkları önlemede önemli rol oynadığı görülmektedir. Toplardamar sisteminde, akışın atımlı olmayan karakterinden kaynaklanan değişiklikler nedeniyle kayma gerilmesi düşüktür ve 0.076-0.76 Pa arasındadır. Arterlerde ise yüksek kayma gerilmesi nedeniyle akış laminar ve atımlıdır ve kayma gerilmesi, geniş arterler için 1-7 Pa, daha küçük olan arterioller için ise 2-6 Pa arasındadır. Vasküler hücre biyolojisini laboratuvarda çalışmak, in vivo ortamdaki dinamikleri ve 3 boyutlu yapıyı taklit etmek açısından zordur. In vitro yapılan çalışmalar, paralel plakalar şeklinde hazırlanmış akış haznelerinde damar yapısının iç kısmını oluşturan endotel hücrelerini kayma gerilmesine maruz bırakarak gerçekleştirilmektedir. Bununla birlikte, bunun gibi büyük sistemlerin yerine kullanılabilen ve mikroakışkan teknoloji ile üretilen cihazlar sayesinde kayma gerilmesi başta olmak üzere birçok mekanik kuvvetin etkisi in vitro ortamda araştırılabilmektedir. Mikroakışkan teknoloji kapsamında tasarlanan ve üretilen bu mikroakışkan cihazlar metal, cam ya da polimer malzemeden üretilebilmektedir. Örneğin; genelde hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan mikroakışkan cihazların üretiminde ucuz, biyouyumlu ve saydam olması nedeniyle polidimetilsiloksan kullanılmaktadır. Polidimetilsiloksan malzemeden üretilen mikroakışkan cihazların hücre kültürü uygulamaları ve testlerinde kullanılan geleneksel yöntemlere göre az miktarda örnek ya da madde kullanımı, sabit sıvı akışı ile hücre kültürü ortamının sağlanması gibi üstünlükleri vardır. Aynı zamanda saydam malzemelerden üretilen mikroakışkan cihazların floresans mikroskop ya da spektroskopi incelemelerine uygunluğu hücre davranışının takip edildiği uzun süreli ve yüksek büyütmeli çalışmaların gerçekleştirilmesine imkan vermektedir. Bu tez projesi kapsamında, mikroakışkan kanallar öncelikle, aterosklerotik damar yapısına özgü olacak şekilde dar geçiş bölgelerinde değişen basınç ve kayma gerilmeleri göz önüne alınarak kaviteli yapıda tasarlanıp MEMS teknolojisi ile üretilmiştir. Tasarımı ve simülasyon çalışmaları yapılan düz ve kaviteli mikrokanallara damar duvarının iç yüzeyini döşeyen endotel hücre soyu olan HUVEC hücreleri ekili kaviteli ve düz mikrokanallara şırınga pompa ile medyum akışı verilerek 0.25 ve 0.75 Pa kayma gerilmesi 4 saat boyunca uygulanmıştır (her grup ve kayma gerilmesi için farklı zamanlarda ve ayrı ayrı). Ayrıca TNF-'nın F-aktin ve ICAM-1 sentezini arttırdığı bilindiği için deney grupları TNF- ile muamele edilen ve edilmeyen olacak şekilde iki alt gruba ayrılmıştır. Phalloidin işaretli HUVEC hücrelerinde F-aktin sentezindeki artış multifoton mikroskobu altında incelenmiştir. Floresan ışık yoğunluğu Image J 1.50i programı ile analiz edilmiştir. Sonuçlara göre, TNF- ile muamele edilmeyen grupta, düz ve kaviteli mikrokanallar arasında anlamlı bir fark saptanmamakla beraber kayma gerilmesinin artmasıyla F-aktin sentezinin azaldığı görülmüştür. TNF- ile muamele edilen grupta ise, TNF-'nın F-aktin sentezini muamele edilmeyen gruba göre arttırdığı gözlemlenmiştir. Kayma gerilmesine maruz kalan HUVEC'lerde ICAM-1 gen ekspresyonunda meydana gelen değişiklikler ise qRT-PCR ile incelenmiştir. Sonuçlara göre, TNF- ile muamele edilen ve edilmeyen düz ve kaviteli kanallarda 0.25 Pa kayma gerilmesine maruz kalan hücrelerde ICAM-1 mRNA seviyesi 0.75 Pa grubuna göre daha azdır. Ateroslerotik plak bölgelerinde inflamasyon varlığı nedeniyle monositlerinde sürece olan katkısından dolayı F-aktin protein sentezi ve ICAM-1 mRNA seviyelerine endotel hücrelerinde incelendiği gibi monosit hücrelerinde de incelenmiştir. Bu doğrultuda, THP-1 hücreleri 4, 15 ve 45 Pa kayma gerilmesine ayrı ayrı 0.5 ve 3 saat boyunca maruz bırakılmıştır. Ayrıca TNF-'nın F-aktin ve ICAM-1 sentezini arttırdığı bilindiği için deney grupları TNF- ile muamele edilen ve edilmeyen olacak şekilde iki alt gruba ayrılmıştır. Falloidin işaretli THP-1 hücrelerinde F-aktin protein sentezi floresan mikroskop ile incelenerek floresan ışık yoğunluğu Image J 1.50i program ile analiz edilmiştir. Ortalama ışık yoğunluğuna göre, F-aktin protein sentezi 0.5 saat sonra 4 ve 45 Pa kayma gerilmelerinde belirgin olarak tespit edilmesiyle beraber en büyük artış 15 Pa'da gözlemlenmiştir. Maruz kalma süresi arttıkça da 45 Pa'da F-aktin polimerizasyonunda azalma gözlemlenmiştir. F-aktin protein sentezindeki artış en çok 15 Pa kayma gerilmesinde görüldüğünden THP-1 hücrelerinde ICAM-1 mRNA seviyesinin belirlenmesi sadece 15 Pa'da qRT-PCR ile incelenmiştir. Sonuçlara göre, kontrol grubuna göre deney grubunda yaklaşık iki kat artış gözlemlenmiştir. Aterosklerotik bölgelerde monosit ve endotel hücrelerinden lökosit çağrımı için salgılanan IL-8 kemoçekim molekülünün kayma gerilmesine maruz kalan THP-1 hücrelerinden salgılanma seviyesi incelenmiştir. Bu nedenle THP-1 hücreleri 4, 15 ve 45 Pa kayma gerilmesine 3 saat boyunca maruz bırakılarak IL-8 seviyesi ELISA ile incelenmiştir. Floresan ışık yoğunluğu sonuçlarına göre, kontrol grubuna göre deney gruplarında azalma gözlemlenmiştir. Kontrol grubu dışında, en yüksek seviye 15 Pa'da en düşük seviye ise 45 Pa'da gözlemlenmiştir. Kayma gerilmesinin endotel ve monosit hücreleri arasındaki tutunmayı nasıl etkilediğini araştırmak için ayrı ayrı 0.5 ve 3 saat boyunca 15 Pa kayma gerilmesine maruz kalan Hoescht 33342 floresan işaretli THP-1 hücreleri kuyucuklara ekilen HUVEC hücreleri üzerine eklenerek 1 saat inkübasyondan sonra yıkanıp HUVEC hücrelerine tutunan hücrelerin floresan mikroskopta görntüleri alınmıştır. Tutunan hücre sayıları Image J 1.50i program ile sayılmıştır. Sonuçlara göre, kayma gerilmesine maruz kalma süresi arttıkça tutunma seviyesinin azaldığı gözlemlenmiştir. Gerçekleştirilen bu incelemelerden elde edilen veriler, ateroskleroz tedavisinde hedef alınan moleküler mekanizmanın belirgin bir şekilde ortaya konmasını sağlayarak bilimsel ortamlarda yapılacak yayınlar ile ileride yapılacak olan tanı, tedavi ve yeni ilaç tasarımlarına imkan sağlayacaktır. Ayrıca kayma gerilmesine maruz kalan hücrelerde ilgili moleküllerde meydana gelen değişikliklerin mikroakışkan sistemler ile incelenmesi nanoteknoloji alanında yapılacak çalışmalara büyük katkı sağlayacaktır.
Özet (Çeviri)
In human physiology, it is known that cells can sense not only biochemical signals but also physical factors which employee in tissue functionality such as mechanical forces, geometry and matrix flexibility. Mechanobiology is the field of these physical factors function basically through mechanotransduction process. The mechanotransduction is a physiological process that is needed to sense mechanical forces and the conversion of these forces into electrical and biochemical signals. For instance, tensile strength, compression and shear stress, are the most important mechanical stimulations which have influence on cells in body. These mechanical stimulators playing major role on regulation of cellular functions like gene expression, protein synthesis, cell growth, differentiation and death which are necessary for providing the maintenance of tissue balance by triggering different electrophysiological and biochemical responses. Traction forces formed by sensing extracellular environment and responses to this environment can affect many biological processes like wound healing, angiogenesis and metastasis at cell level. Therefore, characterization of these mechanical forces in terms of magnitude and direction could be meaningful in pretending and understanding the physiological and pathological events at tissue and organ level. In tissue and organ level, shear stress which is described as the friction force per unit area in blood has tremendous importance in terms of evolution and physiology over the endothelial cells covering the inner surface of vascular network to maintain the physiological conditions. This shear stress is related to flow rate gradient on the cross section of a tube. While velocity is maximum at center, it is zero near to the inner surface. It is known that the biological responses to shear stress takes a significant part of preventing vascular diseases. Due to non-pulsatile characteristic of venous system, shear stress levels are low and between 0.076-0.76 Pa. In arterial system, flow is laminar and pulsatile with high shear stress levels that are between 1-7 Pa for large arteries and between 2-6 Pa for arterioles. Studying vascular cell biology in laboratory is difficult in terms of mimicking the dynamics in vivo environment and 3D structures. Work done by in vitro is achieved by exposing the endothelial cells into shear force in flow chambers composed of parallel plates. Besides, thanks to the devices produced by microfluidic technology which can be used instead of huge systems such as parallel plate or cone plate flow chambers, the mechanical forces, especially shear stress can be studied in in vitro environment. Because of being cheap, biocompatible and transparent, poly(dimethylsiloxane) is used in production of microfluidic devices which is used usually in cell biology studies. There are some advantages of microfluidic devices produced by poly(dimethylsiloxane) like using small amount of sample or agents, providing cell culture environment with stable liquid flow compared to traditional methods used in cell culture applications and analysis. Also, microfluidic devices are made of transparent materials, have suitability to fluorescence microscope or spectroscopy studies which enable monitoring cell behavior under long-term and high amplification conditions. In this thesis, the microchannels were designed as cavitated to mimic the environment of the atherosclerotic plaque where the shear stress and pressure difference occur depending on the diameter of the vessels and fabricated using MEMS techniques.. HUVEC is endothelial cells which is lining the inner surface of the wall seeded in the straight and cavitated microchannels were subjected to shear stress at 0.25 and 0.75 Pa, separately, for 4 hours by the syringe pump. Also, there are two subgroups as TNF--treated and untreated. The change of F-actin level in HUVEC was investigated under fluorescence microscope and fluorescence intensity of F-actin protein level was examined by Image J 1.50i programme. According to the results, there is a significant increase at 0.25 Pa in straight microchannel group with respect to control counterpart for untreated group. There is a significant decrease at 0.75 Pa groups compared to 0.25 Pa groups but MFI increased only in 0.25 Pa straight microchannel compared to control. Overall, the MFI of F-actin at 0.25 Pa is significantly higher than 0.75 Pa for TNF--untreated group. In TNF--treated group, there is not any significant difference between experimental groups. The change of ICAM-1 mRNA levels in HUVEC cells was investigated by qRT-PCR. For untreated group, there is significant increase at 0.25 Pa in cavitated group. The mRNA expression level at straight groups are lower than cavitated groups. For TNF--treated group, the mRNA expression level at 0.25 Pa is higher than 0.75 Pa for cavitated group. There is a significant difference between straight and cavitated groups at 0.25 Pa. The mRNA expression level at 0.25 Pa cavitated group is higher than control. F-actin synthesis and ICAM-1 mRNA levels have also been investigated in monocyte cells as examined in endothelial cells due to the contribution of monocytes to the process of inflammation in atherosclerotic plaque regions. In this direction, THP-1 cells were exposed to 4, 15 and 45 Pa shear stress, for 0.5 and 3 hours, separately. In addition, since TNF- is known to enhance the synthesis of F-actin polymer and ICAM-1 gene expression, experimental groups were divided into two subgroups, treated and not treated with TNF-. F-actin synthesis in Phalloidin labeled THP-1 cells was examined by fluorescence microscopy and fluorescence intensity was analyzed by Image J 1.50i program. According to the mean fluorescence intensity, F-actin synthesis was observed significantly increased at 4 Pa and 45 Pa shear stresses after 0.5 h, while the greatest increase was observed at 15 Pa. As the duration of exposure increased, a decrease in F-actin polymerization was observed at 45 Pa. Since the increase in F-actin synthesis was seen at a maximum 15 Pa shear stress, the determination of ICAM-1 mRNA level in THP-1 cells was only examined by qRT-PCR at 15 Pa. According to the results, about two-fold increase was observed in the experimental group compared to the control group. The releasing level of IL-8 chemokine molecule from THP-1 cells exposed to shear stress which secreted for leukocyte recruitment from monocyte and endothelial cells in atherosclerotic regions was examined. For this reason, the level of IL-8 in THP-1 cells were exposed 4, 15 and 45 Pa shear stress for 3 hours was examined by ELISA. According to the fluorescence intensity results, a decrease in the experimental groups was observed compared to the control group. Except the control group, the highest level was observed at 15 Pa and the lowest level at 45 Pa. Hoescht 33342 fluorescently labeled THP-1 cells were exposed to 15 Pa shear stress for 0.5 and 3 hours, respectively, were added to the HUVEC cells seeded in the wells and incubated for 1 hour, the florescence images were taken after incubation to investigate how the shear stresses affected the adhesion between the endothelial and monocyte cells. The number of cells adhered to HUVEC cells was analysed with Image J 1.50i programme. According to the results, as the duration of exposure to shear stress increases, the degree of adhesion decreases. Data obtained from these experiments will enable diagnostic, treatment and new medicine designs by revealing the targeted molecular mechanism definitely in atherosclerosis treatment within the scientific area by the future. Furthermore, examination of the changes in the molecules involved in sheared cells by microfluidic systems will greatly contribute to the work to be done in the field of nanotechnology.
Benzer Tezler
- Mikrokanallarda basınç düşümü, cidar kayma gerilmesi ve partikül fokuslanmasının sayısal olarak incelenmesi
Numerical investigation of pressure drop, shear stress and particle focusing in microchannels
UFUK DEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Makine Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HASAN GÜNEŞ
- Investigation of biological flows through particle image velocimetry (PIV) combined with several imaging techniques
Parçacık görüntülemeli hız ölçümü (PIV) ve farklı görüntüleme yöntemlerinin birleştirilerek biyolojik akışların incelenmesi
FAZIL EMRE USLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Bilim ve TeknolojiKoç ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. KEREM PEKKAN
- Deneysel ayarlanabilir sütür ile şaşılık cerrahisimodelinde suramin, genistein ve duragen bariyermatriksin mekanik, immünhistokimyasal vehistopatolojik etkileri
Mechanical, immunhistochemical and histopathological effects of suramine, genistein and duragen barrier matrix in stabismus surgery model wi̇th experimental adjustable suture
ÇAĞLAR ÖKTEM
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2007
Göz HastalıklarıBaşkent ÜniversitesiGöz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. SİBEL OTO
- Rüzgâr türbini kanatlarındaki buzlanmanın türbin yüklerine etkisinin incelenmesi
Wind turbine load analysis of blade icing condition
CEM ŞAHİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Enerjiİstanbul Teknik ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ZEYNEP PARLAR