Functionalized nanofiber based scaffold in nerve tissue engineering
Sinir doku mühendisliğinde işlevselleştirilmiş nanofiberlerin kullanımı
- Tez No: 485213
- Danışmanlar: DOÇ. DR. FATMA NEŞE KÖK, PROF. DR. GAMZE KÖSE
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Bilim ve Teknoloji, Biyoteknoloji, Genetik, Science and Technology, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 152
Özet
Omurilik yaralanmaları kalıcı motor ve duyusal hasarlara yol açan tahrip edici travmalardır. Omurilik yaralanmalarının başlıca sebepleri trafik kazaları, spor travmaları, düşmeler ve şiddet eylemleri olarak sıralanmaktadır. Ulusal Omurilik Yaralanmaları Derneği istatistik verilerine göre Amerika'da her yıl 13.400 yeni vaka görülmektedir ve yaralanmalar sonucu oluşan hasarlar, omuriliğin kısıtlı rejenerasyon yetisi nedeniyle çoğunlukla kalıcı hasara dönüşmektedir. Rehabilitasyon ve fizik tedavi gibi bazı destekleyici terapiler bulunmaktadır. Ayrıca halihazırda devam eden klinik araştırmalar bulunmaktadır. Ancak omurilik yaralanmalarına yönelik kesin tedavi henüz ortaya konulmamıştır. Doku mühendisliği stratejileri hasar gören dokularda ve hücrelerde rejenerasyonun ve iyileşmenin sağlanması amacıyla kullanılmaktadır. Bu nedenle hasar gören nöronların rejenere olması ve kopmuş sinir bağlantılarının tekrar kurulmasıyla omurilik hasarlarının tedavi edilmesine yönelik pek çok doku mühendisliği çalışması bulunmaktadır. Doku mühendisliğindeki temel yaklaşım, zarar gören bölgenin, dokunun 3 boyutlu yapısını taklit eden bir iskele yardımıyla desteklenmesidir. Yaralanan dokuda hasar gören hücreleri yenilemek, büyüme faktörlerinin ve ECM proteinlerinin salımı aracılığıyla rejenerasyonu hızlandırmak ve konak hücrelerin onarımlarını teşvik etmek amacıyla bu iskele yapısıyla beraber otojenik, allojenik veya zenojenik hücreler nakledilir. Sinir doku mühendisliğinde, çok farklı doku iskeleleri tasarlanmaktadır, ancak en başarılı sonuçlar mikro- ve nanofiber doku iskelelerinden elde edilmektedir. Bunun sebebi fiber yapıların sinir dokunun doğal yapısına benzer morfoloji göstermesidir. Embriyonik kök hücreler, mezenkimal kök hücreler, Schwann hücreleri gibi birçok hücre tipi de omurilik yaralanmalarının tedavisine yönelik çalışmalarda kullanılmaktadır. Ancak ideal iskelenin elde edilmesi için araştırmalar devam etmektedir. Sinir doku mühendisliğine yönelik iskelelerin yapımı için, farklı biyomateryaller kullanılabilir ve biyobozunur alifatik polyesterler en çok tercih edilen polimerlerdir. PLLA biyobozunur termoplastik alifatik bir polyesterdir ve doku mühendisliği uygulamalarında sıklıkla kullanılır. PBSu da diğer bir biyobozunur termoplastik alifatik polyesterdir ve endüstriyel uygulamalarda kullanımı yaygındır. Ancak PBSu'nun biyomedikal alanda kullanımı oldukça sınırlıdır ve bu alanda uygulamaları görece yenidir. Özellikle sinir doku mühendisliği çalışmalarında PBSu daha önce kullanılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, omurilik yaralanmalarında mekanik olarak hasar görmüş nöron ve aksonlarda rejenerasyonu sağlayabilecek yönlendirilmiş ve işlevselleştirilmiş nanofiberlerden ve destekleyici hücrelerden oluşan bir doku iskelesinin oluşturulmasıdır. Amacımıza ulaşmak için, yukarıda bahsi geçen stratejiler birleştirilmiş ve kopan sinirlerin iyileşmesi için kullanılacak bir entegre iskele yapısı tasarlanmıştır. Yapının dış kılıf ve iç matris olmak üzere iki temel kısmı bulunmaktadır. Tasarımımızın dış kılıf kısmının gözenekli silindirik bir yapı olması ve böylece iskelenin bütünlüğünün sağlanması öngörülmüştür. İç kısımda ise yönlendirilmiş nanofiberler kullanılarak doğal sinir dokusunun taklit edilmesi ve nöral bağlantının tekrar kurulması hedeflenmektedir. İskele yapısının taşıyıcı kısımları PLLA ve PBSu polimerlerinin karışımından hazırlanmıştır. Önerilen tasarımın en önemli özelliği yönlendirilmiş nanofiberlerin yüzeylerinin YIGSR sentetik peptide ile işlevselleştirilmesidir. Bu peptidler Laminin-I proteininden türeyen nöroaktif peptid dizileridir ve hücrelerin nöronlara farklılaşması ve hasarlı bölgede rejenerasyonun desteklenmesi için kullanılmıştır. Özellikle mezenkimal kök hücrelerin ekildiği işlevselleştirilmiş ve yönlendirilmiş nanofiberlerin iyileşmeyi hızlandırması, akson uzamasını ve kök hücrelerin farklılaşmasını sağlaması beklenmektedir. Bu çalışmada yönlendirilmiş nanofiberlere kimyasal olarak bağlanan peptidlerin etkileri araştırılmıştır. Tasarlanan iskele yapısında, rejenerasyon potansiyelinin arttırılması için mezenkimal kök hücreler ve Schwann hücreleri birlikte kullanılmıştır. Mezenkimal hücrelerin iç matrisi oluşturan nanofiberlerin üzerine ekilerek, olgun nöronlara dönüşme kapasiteleri ile hasarlı dokunun restorasyonu amaçlanmaktadır. Buna ek olarak ise dış kılıfın iç gözenekli kısmına Schwann hücrelerin ekilmesi ve bu hücrelerden büyüme faktörlerinin salımı ile rejenerasyonun iyileştirilmesi ve mezenkimal kök hücrelerin farklılaşması hedeflenmiştir. Bu çalışmada öncelikle tasarımın dış kısmı PLLA/PBSu polimerlerinden oluşturulmuştur. Farklı karışım oranları seçilmiş ve tuz uzaklaştırma metodu ile polimerik süngerler imal edilmiştir. Üretilen süngerler Taramalı Elektron Mikroskobu ile görüntülenmiş ve yüzeylerin gözeneklilikleri analiz edilmiştir. 120 günlük inkübasyon ile bu süngerlerin in vitro biyobozunma profilleri araştırılmıştır. Farklı karışım oranlarının biyouyumluluklarının değerlendirilmesi için, polimerik süngerler üzerinde Schwann hücreleri büyütülmüş ve in vitro hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Tüm bu sonuçlar ışığında, en ideal karışım oranı PLLA/PBSu (3%, w/v, 2:1) olarak belirlenmiştir. Tasarımının iç matrisi için, elektroeğirme metodu kullanılarak yönlendirilmiş nanofiberler üretilmiştir. Doku mühendisliğinde kullanılmak üzere PBS polimerinden nanofiberlerin fabrikasyonu için oldukça kısıtlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu nedenle bir çok farklı çözücü ve polimer konsantrasyonu denenmiştir. Nanofiberlerin yapımı için PBSu polimeri PLLA polimeri ile karıştırılmıştır ve elde edilen fiberler Taramalı Elektron Mikroskobu ile görüntülenmiştir. Nanofiberler için in vitro biyobozunma çalışması gerçekleştirilmiştir. Ayrıca yönlendirilmiş nanofiberlerin çekme direnci de Dinamik Mekanik Analiz (DMA) yöntemi ile ölçülmüştür. Yönlendirilmiş nanofiberlerin işlevselleştirilmesinden önce, nanofiberlerin üzerine Schwann hücreleri ekilmiş ve yönlendirilmiş nanofiberlerin biyo-uyumluluğu in vitro hücre kültürü çalışmaları ile araştırılmıştır. Hücre proliferasyonu ölçülmüş ve hücrelerin nanofiberler üzerindeki yerleşimi ve büyümesi Taramalı Elektron Mikroskobu ve Konfokal Mikroskobu ile görüntülenmiştir. Böylece bu çalışmalar ışığında yönlendirilmiş nanofiberlerin Schwann hücrelerinin iskele yapısı üzerinde hizalanmasını sağladığı kanıtlanmıştır.Nanofiberlerin karakterizasyonundan sonra, peptidler ile işlevselleştirilmeleri için EDC/NHS çapraz bağlama (cross-linking) yönteminden yararlanılmıştır. Peptidlerin bağlandığını kanıtlamak için, peptidler floresan boya ile işaretlenmiştir. Böylece bağlama işlemi tamamlandıktan sonra, nanofiberler konfokal mikroskobu ile görüntülenerek peptidlerin fiber yüzeyindeki homojen dağılımı görüntülenmiştir. Oluşturulan iskele yapısının rejenerasyonu ve akson uzamasını tetikleme potansiyeli olduğunu kanıtlamak için, sıçan kemik iliğinden izole edilmiş mezenkimal kök hücreler işlevselleştirilmiş nanofiberler üzerine ekilmiştir ve iskele yapısına nöroaktif peptid bağlamanın etkileri in vitro çalışmalar ile araştırılmıştır. Kök hücrelerin iskele yapısı ile biyouyumluluğunu kontrol etmek için MTS hücre büyüme analizi gerçekleştirilmiştir. Kök hücreler floresan nöral işaretleyiciler ile boyanmış ve rMSCs'lerin farklılaşmaları konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir. Ayrıca yine farklılaşma kapasitesinin gösterilmesi için, farklı hedef genlerin mRNA seviyeleri Real Time PCR ile araştırılmıştır. Çalışmanın sonucunda, PLLA/PBSu karışımının hem sünger hem de yönlendirilmiş nanofiberlerin yapımı için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Sinir hücreleri oluşturulan taşıyıcılarla uyum sağlamıştır. Özellikle, nöroaktif peptidlerle aktifleştirilip, mezenkimal kök hücrelerin ekiminden sonra, yönlendirilmiş nanofiberlerin kök hücrelerin sinir hücrelerini farklılaşmasını tetiklediği ve sinir doku hasarları için umut vaadettikleri ortaya konulmuştur. Sonuç olarak, önerilen tasarımın, in vitro araştırılmaların neticesine göre, sinir doku mühendisliğinde tedavi amaçlı kullanılabilecek alternatif bir iskele yapısı olduğu kanıtlanmıştır.
Özet (Çeviri)
Spinal cord injury (SCI) is a destructive disorder which leads to chronic pain and permanent disabilities due to motor and sensory dysfunctions. The major causes of SCI are sports and traffic accidents, falls and gunshots. According to statistical data of National Spinal Cord Injury Statistical Center, 13.400 new cases occur each year in US and as the spinal cord have very limited capacity to regenerate, the injury becomes permanent. There are some supportive treatments such as rehabilitation and physical therapy. Besides, there are some ongoing clinical trials. However, complete solution of SCI has not been discovered yet. Tissue engineering approaches are used in order to restore and regenerate the damaged tissues and cells. Therefore, many researchers are focusing on tissue engineering strategies for treatment of spinal cord injuries in order to regenerate the neurons and re-connect the transected neural circuits. Main idea in tissue engineering is to support the injury site with a scaffold which can mimic the 3-D structure of native environment. Autogenic, allogeneic or xenogeneic cells can also be transplanted together with the scaffolds in order to replace the injured cells and enhance regeneration by the secretion of growth factors and other ECM proteins which can trigger the host cells to proceed repair. In neural tissue engineering, there are different types of scaffolds constructed, but the most promising results have been achieved from micro and nanofiber structures as they have similar morphologies to nerves. Various cell types such as embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, Schwann cells have also been used in many studies for treatment of SCI. However, researches are still going on to obtain optimum scaffold. To construct neural tissue engineered scaffolds, different biomaterials can be used and biodegradable aliphatic polyesters are one of the most preferred polymers. PLLA is a biodegradable thermoplastic aliphatic polyester and it is frequently used in tissue engineering applications. PBSu is another biodegradable thermoplastic aliphatic polyester which has been extremely used in industrial applications. However, biomedical applications of PBSu is very limited and it is a rather novel polymer for biomedical applications. Especially PBSu has not been studied in neural tissue engineering studies earlier. The aim of this study is to investigate an optimal scaffold structure from aligned and functionalized nanofibers and supportive cells which can provide regeneration of the mechanically disrupted neurons and axons in SCI. In order to achieve our goal, above mentioned strategies were combined and an integrated scaffold structure was proposed in order to be used to treat transected nerves. The two main parts of the design are the outer sheath and the inner matrix. We suggested to build a porous cylindrical structure for the outer sheath of our designwhich provides the integrity of the construct and the inner matrix was designed to be constructed from aligned nanofibers which mimic the native neural tissue and reconnect the neural circuit. These carrier part of the scaffold was prepared from PLLA polymer blended with PBSu polymer. One of the significant characteristics of the design is the modification of the surface of the aligned nanofibers with synthetic peptides. The nanofibers are functionalized by neuro-active peptide YIGSR which is derived from Laminin-I protein in order to trigger the differentiation of the cells in to mature neurons and support regeneration in the injured site. Especially, it is expected that the MSCs seeded scaffolds can fasten the healing process, provide axon extensions and stem cell differentiation. In this study, the effects of the chemically bound peptides on aligned nanofibers were investigated. In order to increase the regeneration potential, Mesenchymal Stem cells and Schwann cells were also combined with the proposed scaffold. MSCs were seeded on the nanofibers which were located in the cylinder and these cells have the capacity to differentiate into mature neurons and have the potential to restore the injured tissue. In addition to MSCs, the inside walls of the outer cylinder were seeded with the Schwann cells which are expected to secrete neural growth factors to enhance regeneration and provide differentiation of MSCs. In this study, we first built the outer sheath of the design from PLLA/PBSu polymer blend. Different blend ratios were chosen and polymeric sponges were constructed via solvent casting and particulate leaching method. The constructed sponges were visualized via Scanning Electron Microscope and the porosity of the surfaces were analyzed. In vitro degradation profiles of the scaffolds were also investigated by 120 days of incubation. In order to evaluate the biocompatibility of the different blend ratios, Schwann cells were cultivated on polymeric sponges and in vitro cell culture studies were performed. According to the results of these studies, the optimal blend ratio was determined as PLLA/PBSu (3%, w/v, 2:1). For the inner matrix, aligned nanofibers were constructed via electrospinning. There are very limited studies considering PBSu nanofiber fabrication, especially for tissue engineering purposes. Therefore, many different solvents and polymeric ratios were investigated. PBSu was blended with PLLA for aligned nanofiber construction and the scaffolds were visualized via Scanning Electron Microscopy. Degradation study was also performed for the nanofibers. The tensile strength of the aligned nanofibers was measured via Dynamic Mechanical Analysis (DMA). Before functionalization of the aligned nanofibers, Schwann cells were seeded on the constructed scaffolds and the biocompatibility of the aligned nanofibers were investigated as pre-cell culture study. Cell proliferation studies were achieved and alignment of the cells on aligned nanofibers were visualized via Confocal microscopy. Therefore, it was proven by these studies that the directed nanofibers provided the alignment of the Schwann cells on the scaffolds. After the characterization of the scaffold, the peptide functionalization of the scaffold was achieved via EDC/NHS cross-linking. In order to prove the peptide binding, the peptides were labeled via fluorescent tag. The nanofibers were visualized via confocal microscopy and the homogenous distribution of peptides on nanofibers was observed. In order to prove that the constructed scaffold may have the potential to trigger regeneration and axon extension, rat bone marrow mesenchymal stem cells (rMSCs)were seeded on functionalized nanofibers and the effects of the peptide binding to the scaffold were investigated via in vitro studies. MTS cell proliferation assay was used to check the biocompatibility of the scaffold with the stem cells. The cells were also tagged with fluorescent neural markers and confocal microscopy was performed to check the differentiation of rMSCs. The mRNA levels of the different target genes were also investigated to prove differentiation capacity via Real Time PCR application. As a conclusion of the study, it was proven that PLLA/PBSu blend is convenient for scaffold construction both for sponge structures and aligned nanofibers. The neural cells adapted the scaffold successfully. Especially, the aligned nanofibers are promising to be used in neural tissue damages after functionalized by neuroactive peptides and seeded with MSCs as they triggered neural differentiation of MSCs. To sum up, the proposed design can be an alternative scaffold for treatment in neural tissue engineering according to the in vitro investigations.
Benzer Tezler
- Investigation of the effects of bioactive peptide nanofibers on acute muscle injury regeneration
Biyoaktif peptit nanofiberlerin akut kas hasarı üzerindeki etkilerinin incelenmesi
ÇAĞLA EREN
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyomühendislikİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. AYŞE BEGÜM TEKİNAY
- Doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere grafen oksit temelli polimerik nanofibröz doku iskelelerinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of graphene oxide based polymeric nanofibrous tissue scaffolds for tissue engineering applications
RUMEYSA HİLAL ÇELİK
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Biyomühendislikİstanbul Medeniyet ÜniversitesiNanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MURAT KAZANCİ
- Developing peptide modified novel bioactive materials for bone tissue engineering applications
Kemik doku mühendisliği uygulamaları için peptit ile modifiye edilmiş özgün biyoaktif malzemelerin geliştirilmesi
GÜNNUR PULAT
Doktora
İngilizce
2021
Mühendislik Bilimleriİzmir Katip Çelebi ÜniversitesiBiyomedikal Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. OZAN KARAMAN
- Design and synthesis of maleimide-containing biofunctionalizable nanofibers
Maleimid içeren biyofonksiyonelizabilir nanofiberlerin dizaynı ve sentezi
AZİZE KIRAÇ AYDIN
- Bioinspired materials for regenerative medicine and drug delivery applications
Biyoesinlenilmiş malzemelerin rejeneratif tıp ve ilaç taşınımı alanlarında uygulamaları
SEREN HAMSICI
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyomühendislikİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. AYŞE BEGÜM TEKİNAY