p60-katanin (katna1) gene promoter regulatıon by ELK1
p60-katanin (KATNA1) gen promotörünün ELK1 ile regülasyonu
- Tez No: 496332
- Danışmanlar: PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 127
Özet
Hücre iskeletinin dinamik elemanlarından biri olan mikrotubuller, mitotik hücrelerde kromozomların ayrılması ve hücre içi taşınımda, nöronlarda ise dallanma ve nöronal morfojenezin oluşumunda görevlidir. Mikrotubuller, α-tubulin ve β-tubulin alt birimlerini içeren protofilamentlerden oluşmaktadır. Tubulin alt birimlerinin filament zincirine aynı yönde ve aynı sıra ile eklenmesi polimerizasyon, zincirden ayrılması ise depolimerizasyon olarak adlandırılır. Mikrotubullerin artı (+) ucunda β-tubulin, eksi (-) ucunda ise α-tubulin bulunur. Tubulin alt birimlerinin yönelimleri sonucu oluşan kutuplaşma, iki uçtaki polimerizasyon ve depolimerizasyon hızında değişikliğe neden olarak mikrotubul dinamiğinin artmasında oldukça önemlidir. Mikrotubul dinamiğine katkı sağlayan bir diğer mekanizma ise mikrotubul kesimidir. Kısa parçalar halinde bulunan mikrotubullerin hareket kabiliyeti uzun mikrotubullerden daha fazladır ve dolayısıyla mikrotubul kesimi hücre içi hareket için büyük önem arz etmektedir. Katanin, spastin ve figdetin; ATP varlığında mikrotubul kesimini gerçekleştiren enzimlerdir ve kesim mekanizmaları açısından farklılık göstermektedirler. Katanin heterodimerik yapıda bulunan bir proteindir. KATNA1 geni tarafından kodlanan enzimatik aktiviteye sahip p60-katanin ve KATNB1 geni tarafından kodlanan düzenleyici etkiye sahip p80-katanin olmak üzere iki alt birimden oluşmaktadır. Mikrotubul kesimi esas olarak AAA bölgesine sahip p60-katanin tarafından yürütülür. Tek başına kesim işlemini gerçekleştirebildiği bilinmekle birlikte, p60-katanin'in enzimatik aktivitesi p80-katanin varlığında artmaktadır. P80-katanin'in bilinen iki bölgesinden biri p60-katanin'e bağlanmada, diğeri ise protein kompleksini sentrozoma yönlendirmede görevlidir. Bu yönlendirme, nöronlarda mikrotubullerin sentrozomdan kesilerek akson boyunca hareket etmesinde ve dallanmada önem taşımaktadır. Elk1; proliferasyon, tümör gelişimi ve nöronal farklılaşma gibi süreçlerde rol oynayan önemli bir transkripsiyon faktörüdür. ETS ailesinin TCF altgrubu üyesi olan Elk1, bazı genlerin anlatımında aktive edici özelliğe sahip iken bazılarında ise baskılayıcı etki gösterir. Bu mekanizmaların, fosforilasyon ve SUMOlanma olarak adlandırılan iki post-translasyonel modifikasyon ile doğrudan ilişkili olduğu bulunmuştur. Ayrıca bu modifikasyonlar, Elk1 transkripsiyon faktörünün hücre içi yerleşiminde de belirleyici etkiye sahiptir. SUMOlanmanın engellenmesi ve fosforilasyon sonucu çekirdeğe yönelimin arttığı saptanmıştır. Bilinen beş temel bölgeden oluşan Elk1 transkripsiyon faktörünün A bölgesi DNA'ya bağlanmadan sorumlu olmakla birlikte transkripsiyonun baskılanmasında önemlidir. Ayrıca çekirdeğe yönelimi ve çekirdekten çıkışı sağlayan motifleri içerir. Baskılamada görevli olan bir diğer bölge ise R bölgesidir. Bu etkinin SUMOlanma sonucu arttığı ve R bölgesindeki 230., 249. ve 254. Lizin amino asitlerinde oluşan mutasyonların SUMOlanmayı inhibe ettiği öne sürülmüştür. B bölgesi üçüncül yapının oluşmasında görevlidir. C bölgesi, 383. amino asit olan serin ve 389. amino asit olan treoninin hücre dışı sinyaller sonucu D bölgesine bağlanan kinazlar tarafından fosforilasyona uğramasıyla transkripsiyon aktivasyonunda rol oynamaktadır. KATNA1, TATA kutusu içermeyen promotöre sahip olmasından dolayı transkripsiyonun başlaması için diğer düzenleyici dizilere ihtiyaç duymaktadır ve Elk1 konsensus dizisine karşılık gelen M3 motifinin TATA kutusu içermeyen promotörlerde yaygın olduğu bulunmuştur. Ayrıca p60-katanin ve Elk1'ın nöronal farklılaşmada önemli görevlere sahip olması KATNA1 gen anlatımının Elk1 transkripsiyon faktörü tarafından düzenlenebileceği ihtimalini öne sürmektedir. Ayrıca kataninin diğer alt birimi olan p80-katanin'i kodlayan KATNB1 ve mikrotubul kesim aktivitesine sahip diğer bir protein olan spastini kodlayan SPG4 gen anlatımlarının da Elk1 tarafından düzenlendiği laboratuvarımızda daha önceden tespit edilmiştir. Mikrotubul kesiminde görevli olan proteinlerin anlatımını sağlayan genlerin düzenlenmesi ve anlatımdaki değişiklikler hücre içi süreçlerde büyük önem taşımaktadır. Özellikle farklılaşmış hücreler olan nöronlarda bu düzenlemeler kritik sonuçlar doğurmaktadır. Bu çalışmada insan nöroblastoma hücreleri kullanılarak Elk1 transkripsiyon faktörünün KATNA1 gen anlatımı üzerindeki düzenleyici etkisi araştırılmıştır. Öncelikle, Elk1'in KATNA1 dizisi üzerindeki bağlanma bölgesi saptanmıştır. Laboratuvarımızda daha önce, lusiferaz deneyleri ile gerçekleştirilen KATNA1 promotör karakterizasyonu sonucu 5' UTR'nin transkripsiyonda kritik öneme sahip olduğu bulunmuştur. Bu yüzden Elk1'in KATNA1 üzerindeki olası bağlanma bölgeleri hem promotör hem de 5' UTR dizilerinde biyoinformatik araçlarla belirlenmiştir. Rekombinant protein ve bağlanma bölgelerini içeren oligonükleotidler kullanılarak EMSA yöntemi ile Elk1'in KATNA1 üzerindeki esas bağlanma bölgesi tespit edilmiştir. Ayrıca bu sonuçlar kromatin immunopresipitasyon deneyleri ile doğrulanmıştır. Elk1'in KATNA1 mRNA düzeyi üzerindeki etkisi kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile araştırılmış ve mRNA düzeyinin arttığı belirlenmiştir. Ancak protein düzeyini araştırmak üzere yapılan lusiferaz, Western blot ve immunositokimya deneylerinde, p60-katanin seviyesinin Elk1'e bağımlı olarak düştüğü saptanmıştır. Ayrıca, Elk1'in SUMOlanmasının KATNA1 üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, R bölgesindeki kritik olduğu daha önceden belirtilen üç amino asit mutasyona uğratılarak SUMOlanmanın engellenmesi amaçlanmıştır. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, lusiferaz, Western blot ve immunositokimya deneyleri sonucunda, yabanıl tip ve mutant Elk1 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır. Fakat, mutant Elk1'in çekirdeğe yöneliminin arttığını gösteren önceki çalışmaların aksine, hem çekirdek hem de sitoplazmada yerleşim gösterdiği gözlemlenmiştir. Bu yüzden, hem yabanıl tip hem de mutant Elk1'in SUMOlanma miktarı ko-immunopresipitasyon deneyleri ile araştırılmış ve sonuç olarak mutant Elk1'in da SUMOlanma kapasitesine sahip olduğu tespit edilmiştir. TATA kutusu içermeyen promotöre sahip olan genlerin GC içeriğinin daha fazla olduğu bilinmektedir. Bu nedenle KATNA1 promotör ve 5' UTR dizilerinde bulunan CpG adacıkları biyoinformatik araçlar ile araştırılmış ve Elk1 bağlanma bölgesinin de içinde olduğu CpG adacığı saptanmıştır. Dolayısıyla metilasyonun, Elk1 bağlanma kabiliyetini değiştirerek KATNA1 gen anlatımında düzenleyici etkisinin olabileceği düşünülmüştür. Bu nedenle, Elk1 bağlanma bölgesini içeren KATNA1 oligonükleotidi metillendikten sonra hem metillenmiş hem de metillenmemiş oligonükleotidler ve rekombinant protein kullanılarak EMSA deneyi yapılmıştır. Sonuçlar, metilasyonun Elk1'in KATNA1'e olan bağlanma eğilimini azalttığını göstermiştir.
Özet (Çeviri)
Microtubules are highly dynamic cytoskeletal elements, and they are important for chromosome segregation and intracellular transport in mitotic cells as well as neuronal morphogenesis and branching of neurons. Microtubule severing contributes their dynamic nature as a result of leading to depolymerization and polymerization. Katanin has microtubule severing activity and exists as a heterodimeric protein in the cell. There are two subunits of katanin; p60-katanin encoded by KATNA1 and p80-katanin encoded by KATNB1. Microtubule severing is mainly conducted by p60-katanin due to AAA domain and p80-katanin is responsible for enhancing its enzymatic activity. It has been known that katanin severing induces non-centrosomal microtubules in neurons. Also, neuronal branching is associated with microtubule severing. Elk1 is a transcription factor which has a role in cell proliferation, neuronal differentiation and tumor progression. It can act both as transcriptional activator or repressor of a target gene. C domain of Elk1 is known as activation domain while ETS domain and R domain are related with repression. Elk1 has two main post-translational modifications; phosphorylation and SUMOylation. ERK/MAPK phosphorylates Serine 383 and Serine 389 at the C domain. It has been indicated that Lysines located on 230, 249 and 254 at R domain are essential for SUMOylation and point mutations of these amino acids prevent SUMO conjugation. KATNA1 includes M3 motif due to containing TATA-less promoter and this motif corresponds to Elk1 consensus sequence. Besides, in our laboratory, it has been revealed that Elk1 plays a role in KATNB1 gene expression which encodes p80-katanin subunit and SPG4 gene expression which encodes the other microtubule severing protein spastin. The expression mechanisms and regulation of microtubule severing proteins are important for many cellular processes particularly in neurons. In the light of this information, the effect of Elk1 on KATNA1 regulation was investigated in this study. Firstly, the binding site of Elk1 was determined by in vitro and in vivo assays. EMSA was performed using recombinant protein and oligonucleotides that include different binding sites of Elk1 on KATNA1 promoter and 5' UTR. KATNA1 promoter characterization has been previously identified in our laboratory and also 5' UTR is detected as the critical region for KATNA1 transcription. After determining the main binding site, binding was confirmed by ChIP assay. Elk1 regulation on KATNA1 mRNA was investigated through qRT-PCR and it was found that mRNA level was increased due to Elk1 over-expression. However, luciferase reporter assay, Western blot and immunocytochemistry experiments revealed the repressor activity of Elk1 on p60-katanin protein. Also, the effect of Elk1 SUMOylation was investigated by generating point mutations in the R domain as described previously. According to the results of qRT-PCR, luciferase reporter assay, Western blot and immunocytochemistry, no significant change was detected between the effects of wild-type and mutated Elk1. However, it was observed that mutated Elk1 was localized in both nucleus and cytoplasm despite the previous studies which indicate the rapid re-localization of mutated Elk1 to the nucleus. Thus, the SUMOylation levels of both wild-type and mutated Elk1 constructs were investigated through co-immunoprecipitation experiments. It was shown that mutated Elk1 could also be SUMOylated. It has been known that TATA-less promoters have high GC content. Thus, CpG islands in KATNA1 promoter and 5' UTR were investigated through bioinformatic analysis and a CpG island which includes previously identified Elk1 binding site was found. Thus, KATNA1 oligonucleotide was methylated in order to investigate whether methylation is a regulatory mechanism of p60-katanin expression in terms of Elk1 binding ability. EMSA was performed by using both methylated and unmethylated oligonucleotides. Results showed that Elk1 binding ability was decreased due to methylation.
Benzer Tezler
- Regulation of SPG4 and KANTB1 gene expressions by ELK1 transcription factor
SPG4 ve KATNB1 gen anlatımlarının ELK1 transkripsiyon faktörü ile düzenlenmesi
ECE SELÇUK
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Effect of elk1 and YY1 transcription factors on SPG4 and KATHB1 promoters
Elk1 ve YY1 transkripsiyon faktörlerinin SPG4 ve KATNB1 promotorları üzerindeki etkisi
KORAY KIRIMTAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Transkripsiyon faktörü p53 tümör supressör proteininin p60-katanin (KATNA1) promotoru ile etkileşimi
Interaction between transcription factor p53 tumor suppressor and p60-katanin (KATNA1) promoter
MEHTAP KAYA
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Regulation of tau on septin3 in neuronal branching
Septin3' ün nöronal dallanma üzerindeki etkisinin tau tarafından düzenlenmesi
DİDEM BARAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Promoter elements analysis of katanin p80 gene
Katanin p80 geninin promotor elementlerinin analizi
GÜHER IŞIK CESUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2009
Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ