Geri Dön

Functional interaction between helicobacter-stimulated B (Hstim-B) cells and dendritic cells

Helicobacter-stimüle B (Hstim-B) hücreleri ile dendritik hücreler arasındaki fonksiyonel etkileşim

PDF İndir

  1. Tez No: 496494
  2. Yazar: DOĞUŞ ALTUNÖZ
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Allerji ve İmmünoloji, Biyoloji, Genetik, Allergy and Immunology, Biology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 117

Özet

Helicobacter pylori (H. pylori) ilk olarak Robbin Warren ve Barry Marshall tarafından tanımlanan mikroaerofilik, spiral şekilli ve gram negatif bir bakteridir. Dünya populasyonun yaklaşık yarısından fazlası bu bakteri ile enfekte durumdadır; fakat, enfekte bireylerin sadece %10-20'sinde ciddi gastrointestinal hastalıklar gözlenmektedir. Geriye kalan enfekte bireylerde semptom vermeyen gastrit gözlenmektedir. H. pylori mide kanserine neden olabilen bir bakteridir; dolayısıyla, Dünya Sağlık Örgütü tarafından tip-1 karsinojen olarak sınıflandırılmıştır. Farelerde H. pylori'ye karşı etkin bir immün yanıt oluşmadığından; fare hastalık modelinin oluşturulmasında Helicobacter felis (H. felis) kullanılmaktadır. İlk olarak Steinmann tarafından tanımlanan dendritik hücreler (DC), antijen sunan hücrelerden biridir ve yabancı antijenlere karşı spesifik immün yanıt oluşturulmasında etkili olduklarından doğal ve kazanılmış immün yanıt arasındaki bağlantının oluşturulmasında önemlidir. Regülatör dendritik hücreler IL-12 ve eşuyarıcı proteinleri (CD40, CD80 ve CD86 gibi) düşük düzeyde eksprese ederken PD-L1, CD95L ve indolamin 2,3 dioksijenaz (IDO) gibi baskılayıcı molekülleri yüksek düzeyde eksprese ederler. Öte yandan, olgun olmayan DC'lerin yanı sıra CD11c+MHCIIyüksekCD80/CD86yüksekIL-12-TNF-α-IL-10+ fenotipine sahip olan yarı olgun DC'lerin tolerojenik rollerinin olduğu düşünülmektedir. B hücreleri, antikor üretimi ve antijen sunmak gibi efektör görevlerinin yanı sıra immün sistemin regüle edilmesinde önemli role sahiptir. B hücrelerinin regülatör özellikleri, B hücrelerden yoksun farelerin otoimmün ensefalopati hastalığının üstesinden gelememeleri sonucu ortaya çıkmıştır. H. felis, B hücrelerini TLR2 ve MyD88 aracılığıyla aktive eder ve tip-1 regülatör T (Tr1) benzeri hücrelerin farklılaşmasını indükleyerek immün yanıtı in vivo ve in vitro'da baskılar. Bu baskılama hastalığın iyileşmesinde arttırıcı etki gösterirken bakterinin mide mukozasında kronik bir biçimde bulunmasına neden olmaktadır. Dolayısıyla, regülatör ve efektör immün yanıt arasındaki denge enfeksiyonun nasıl sonuçlanacağını belirleyebilmektedir. H. felis-aracılı B hücre aktivasyonu sonucunda IL-10 üreten IL-10+ B hücreleri ve TGF-β üreten IL-10- B hücreleri olmak üzere iki farklı B hücre alt grubunun farklılaştığı laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar ile gösterilmiştir. Bu çalışmadaki ilk amaç, H. felis'in fare kemik iliği kökenli DC'ler üzerine olan etkilerini belirlemektir. İkinci amaç ise, Helicobacter felis-stimüle B (Hfstim-B) hücrelerinin kemik iliği kökenli DC'ler (BM-DCs) üzerine etkilerini araştırmaktır. Bu deneylerin gerçekleştirilmesi için; C57BL/6 farelerden alınan kemik iliği hücreleri IL-4 ve GM-CSF varlığında olgun olmayan DC'lere farklılaştırılmıştır. B hücreleri ise, C57BL/6 farelerin dalaklarından manyetik ayırım aracılığıyla izole edilmiştir. Daha sonra, IL-10+ B ve IL-10- B hücre alt gruplarının yine manyetik ayırım ile elde edilebilmesi için, B hücreleri H. felis sonikatı ile muamele edilmiştir. IL-10+ B ve IL-10- B hücre alt gruplarının manyetik ayırım yöntemiyle izolasyonunun ardından; hücrelerin salgıladıkları moleküllerin elde edilebilmesi için bu hücreler H. felis sonikatı ile uyarılmıştır. Salgıladıkları molekülleri içeren medyumun DC'ler üzerine uygulanmasından sonra hücreler yıkanmış ve BM-DC'ler LPS veya H. felis sonikatı ile muamele edilmiştir. DC'lerin sitokin profilleri ve aktivasyon durumları protein ve gen düzeyinde belirlenmiştir. Bununla beraber, DC'lerin fonksiyonel analizleri için DC'ler naif CD4+ T hücreleri ile 1:2 oranında (DC:T) 10 ng/ml IL-2 and 1 µg/ml anti-CD3Ԑ varlığında kültürde tutulmuştur. Daha sonra, farklı gruplardaki IL-10 salgılayan CD4+ T hücrelerinin oranları akan hücre ölçer analizleri ile belirlenmiştir. H. felis, DC'lerden IL-12/IL-23 (p40), IL-1β, TNF-α ve IL-10 salgılamalarını indüklemiştir. Bununla uyumlu olarak, IL-12/IL-23 (p40), TNF-α, IL-10 ve IL-6'nın gen ifade düzeyleri indüklenmiştir. Ayrıca, akan hücre ölçer analizleri H. felis'in DC'lerin CD86 ifadesindeki artış ile aktive ettiğini göstermiştir. IL-10+ B ve IL-10- B hücreleri de dahil olmak üzere Hfstim-B hücre grupları, herhangi bir antijenik uyarımın yokluğunda DC'lerin CD86 ifadesini indüklemiştir. Fakat, IL-10+ B hücre salgıları ile uyarılan ve IL-10- B hücre salgıları ile uyarılan DC'ler arasında CD86 ifadesi açısından anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bununla beraber, Hfstim-B, IL-10+ B ve stimüle edilmeyen B hücrelerinin salgıları ile uyarılan DC'lerde LPS veya H. felis sonikatı ile muamelenin ardından kontol grubuna göre IL-10 salgılanması farklılık göstermemiştir. Fakat, LPS ile muamele edilen grupta IL-10- B hücre salgıları ile uyarılan DC'lerde IL-10 salgılanması azalmıştır ve ayrıca LPS veya H. felis ile muamele edilen gruplarda, IL-10+ B hücre salgıları ile uyarılan DC'lerin IL-10- B hücre salgıları ile uyarılan DC'lere göre daha fazla IL-10 salgıladıkları gözlenmiştir. Bütün Hfstim-B hücre gruplarının salgıları DC'lerden IL-12 salgılanmasını aynı oranda indüklerken; LPS veya H. felis ile muamele edilen gruplarda TNF-α salgılanmasında baskılanma gözlenmiştir. Hfstim-IL-10+ B hücre salgıları ile uyarılan ve sonradan LPS veya H. felis sonikatı ile muamele edilmeyen DC'ler olgun olmayan kontrol DC grubu ile benzer oranda IL-10 üreten CD4+ T hücrelerinin farklılaşmasını sağlamıştır. Ayrıca, önceden stimüle edilmeyen B hücreleri, Hfstim-B hücreleri veya Hfstim-IL-10- B hücreleri ile kültürde tutulup ardından LPS ile muamele edilen DC gruplarında sadece LPS ile muamele edilen DC'lere göre daha az IL-10 üreten CD4+ T hücreleri gözlenmiştir. B hücre salgılarıyla stimüle edildikten sonra H. felis sonikatı ile muamele edilen DC gruplarında IL-10 salgılayan CD4+ T hücre oranları açısından bir fark gözlenmemiştir. Dolayısıyla, IL-10'a ek olarak farklı Hfstim-B hücre altgruplarının salgıları ile uyarılmış DC'lerden üretilen başka faktörler IL-10 üreten CD4+ T hücrelerinin farklılaşmasında etkili olmaktadır. Bu analizlere ek olarak, hücreler arasındaki direkt etkileşimin rolünün değerlendirilmesi için olgun olmayan fare kemik iliği kökenli DC'ler Hfstim-B hücreleri ile 1:1 ve 1:2 oranında (DC:B) kültürde tutulmuştur ve sonrasında LPS ve H. felis sonikatı ile muamele edilmiştir. Hfstim-B hücreleri ve olgun olmayan DC'ler arasındaki hücreler arasındaki direkt etkileşim DC'lerin CD86 ekspresyonlarını arttırarak DC'leri aktive etmektedir. B hücreleri tek başına DC'lerin IL-10 ve TNF-α salgılamalarını indüklememektedir. Fakat, 1:1 oranında kültürde B hücreleri ile etkileşimin ardından, DC'lerin LPS veya H. felis sonikatı ile muamelesi DC'lerin IL-10 salgılamalarının azalmasına neden olmuştur. Bununla beraber, LPS ile muamelenin öncesinde DC'lerin B hücreleriyle 1:2 (DC:B) oranında olacak şekilde tutulması DC'lerin IL-10 üretimini indüklemiştir; bunun tersine, stimüle edilmeyen B hücreleri aynı koşullarda DC'lerin IL-10 salgılamasını baskılamıştır. Ayrıca, LPS veya H. felis sonikatı ile muamelenin öncesinde stimüle edilmeyen veya Hfstim-B hücreleri ile 1:2 (DC:B) oranında etkileşen DC'lerin TNF-α salgılamalarında etkili bir baskılanma gözlenmiştir. Dolayısıyla, DC'ler ile kültürde tutulan B hücrelerinin sayısı, B hücrelerinin DC'ler üzerindeki regülatör etkilerini göstermelerinde etkili bir faktör olabilir. İlginç bir şekilde, Hfstim-IL-10+ B veya Hfstim-IL-10- B hücreleri direkt etkileşimde oldukları DC'lerin TNF-α salgılamalarını etkilememiştir. Dolayısıyla; IL-10'a ek olarak Hfstim-B hücrelerinden salgılanan diğer moleküller direkt hücre etkileşimi ile birlikte DC'lerin aktivasyonu ve fonksiyonu üzerine regülatör role sahiptir. Sonuç olarak; ilk olarak, DC'lerin in vitro'da H. felis antijenlerine yanıt olarak aktive oldukları ve pro-enflamatuvar ve anti-enflamatuvar sitokinleri salgıladıkları söylenebilir. İkinci olarak da; Hfstim-B hücrelerinin olgun olmayan fare kemik iliği kökenli DC'leri IL-10 salgılayan tolerojenik forma dönüştürdüğü önerilmektedir. Bu çalışmada, H. felis antijenlerinin kemik iliği kökenli DC'ler üzerine etkileri ayrıntılı bir şekilde gösterilmiştir. Ayrıca, çalışmamız Hfstim-B hücre alt gruplarıyla kemik iliği kökenli DC'lerin ex vivo ortamdaki etkileşimlerini araştıran ilk çalışmadır.

Özet (Çeviri)

Helicobacter pylori (H. pylori) is a microaerophilic gram negative and spiral-shaped bacterium which is firstly identified by Robbin Warren and Barry Marshall. About more than 50% of the people in the world have been infected with this bacterium; however, the bacteria cause serious gastrointestinal diseases only in 10-20% of infected people, whereas the remaining infected people has only asymptomatic gastritis. H. pylori can lead to development of gastric cancer and categorized as a group-I carcinogen by World Health Organization. Due to lack of efficient immune response against H.pylori in murines; mice has been infected with Helicobacter felis (H. felis) to create mouse model of Helicobacter infection. Dendritic cells (DCs) which are firstly identified by Steinmann, are the member of antigen presenting cells (APCs) and provide a connection between innate and adaptive immune response due to having a crucial role for activation of specific immune response against foreign antigens. Regulatory DCs express low levels of IL-12 and co-stimulatory molecules such as CD40, CD80 and CD86. Instead, expression of inhibitory molecules such as IL-10, PD-L1, CD95L and indoleamine 2,3 deoxygenase (IDO) are upregulated in regulatory DCs. Moreover, in addition to immature DCs, also semi-mature DCs characterized with MHC-IIhiCD80/CD86hiIL-12-TNF-α-IL-10+ phentotype are thought as tolerogenic DCs and inducer of type-1 regulatory T (Tr1) cell-mediated immune suppression. B cells have an important role for regulation of immune response in addition to their effector roles such as antibody production and antigen presentation. Regulatory role of B cells was shown with the use of mice lacking B cells which was not able to overcome autoimmune encephalitis. Helicobacter felis activates B cells via TLR2 and Myd88 and suppress immune responses in vivo and in vitro by triggering IL-10-producing Tr1-like cells. This suppression results in persistency of bacteria in gastric mucosa and decrease in pathology score. Therefore, balance between regulatory and effector response could determine the fate of infection. As demonstrated by our previous laboratory studies, H. felis-mediated activation of B cells induce two different B cell subgroups: IL-10-producing IL-10+ B cells and TGF-β-producing IL-10- B cells. Our first aim was to understand the effects of H. felis on bone marrow-derived dendritic cells (BM-DCs). Second aim was to determine effects of Helicobacter-stimulated B (Hfstim-B) cells on bone marrow-derived dendritic cells (BM-DCs). To perform these experiments; C57BL/6 mouse bone marrow cells were differentiated into immature dendritic cells in the presence of IL-4 and GM-CSF. B cells were magnetically isolated from spleens of C57BL/6 mice and treated with H. felis sonicate in order to obtain Helicobacter-stimulated IL-10+ B and IL-10- B cells through magnetic separation. Afterwards, these B cell subgroups were treated with H.felis sonicate, their supernatant were collected and applied onto immature BM-DCs. Following incubation and washing of the cells, BM-DCs were treated with LPS or H. felis sonicate. Cytokine profile and activation status of DCs were determined on protein and expression level. Moreover; for functional analysis, these DCs were co-cultured with naive CD4+ T cells at a ratio of 1:2 (DC:T) in the presence of 10 ng/ml IL-2 and 1 µg/ml anti-CD3Ԑ. Then, frequency of IL-10 secreting CD4+ T cells in different groups were analyzed by flow cytometry. H. felis-induced BM-DCs secrete IL-12/IL-23 (p40), IL-1β, TNF- α and IL-10 into the culture medium. Consistently, expression of IL-12/IL-23 (p40), TNF-α and IL-10 in addition to IL-6 was also induced. Flow cytometric analysis showed that H. felis activates DCs and causes upregulation of CD86 expression. All Hfstim-B cell groups including IL-10+ B and IL-10- B cells, induced DCs to express CD86 molecules in the absence of additional antigenic stimulation. However, there was no difference between DC groups stimulated with supernatant of IL-10- B and IL-10+ B in terms of expression of CD86 in untreated and LPS- or H. felis-treated groups. Moreover, IL-10 secretion was not induced upon stimulation of DCs with supernatant of unstimulated B, Helicobacter felis-stimulated B (Hfstim) or IL-10+ B cell followed by LPS or H. felis sonicate treatment. Nevertheless, DCs secreted significantly more IL-10 upon stimulation with IL-10+ B cell followed by LPS or H.felis treatment compared to IL-10- B cell supernatant stimulation. IL-12 secretion from DCs was induced by supernatant of all Helicobacter-stimulated B cell types. Strikingly, TNF-α secretion from DCs was suppressed upon stimulation of DCs with Hfstim-B cell supernatant prior to LPS or H. felis treatment. Interaction of BM-DCs with supernatant of Hfstim-IL-10+ B cells in the absence of subsequent LPS or H. felis treatment retained the frequency of IL-10-producing CD4+ T cells generated by immature DCs. Moreover, LPS treatment of DCs which had been previously stimulated with supernatant of unstimulated B cells, Hfstim-B cells or Hfstim-IL-10- B cells, but not Hfstim-IL-10+ B cells, resulted in the decreased frequency of IL-10-producing CD4+ T cells compared to LPS-treated control group. However, H. felis treatment of DCs following stimulation with supernatant of B cells have no effect on DCs to induce IL-10-producing CD4+ population. Therefore, it is possible that in addition to IL-10, also some other factors may be involved in differentiation of IL-10-producing CD4+ T cells by DCs stimulated with supernatant of different Hfstim-B cells subgroups. Furthermore, immature BM-DCs were co-cocultured with Hfstim-B cells at a ratio of 1:1 and 1:2 (DC:B) to evaluate the role of cell-to cell contact on this interaction. Accordingly, direct contact between Hfstim-B cells and immature DCs activates DCs and upregulates CD86 expression. B cells alone did not induce any IL-10 and TNF-α secretion regardless of the ratio between DC and B cell. However LPS or H. felis treatment of DCs after interaction with B cells resulted in decreased IL-10 production when the ratio between these cells was 1:1. Importantly, interaction of immature BM-DCs with Hfstim-B cells prior to LPS treatment induced production of IL-10 by DCs; whereas, unstimulated B cells exhibited inhibitory effect on IL-10 production when the ratio between these cells was 1:2 (DC:B). Moreover, TNF-α production by DCs was inhibited efficiently by Hfstim-B cells and unstimulated B cells when BM-DCs were co-cultured with these B cells at a ratio of 1:2 (DC:B) prior to LPS or H. felis treatment. It seems that the number of B cells co-cultured with immature DCs could be a critical factor to exhibit their regulatory function on DCs. Interestingly, Hfstim-IL-10+ B cells and Hfstim-IL-10- B cells did not affect the production of TNF-α by DCs. Collectively; some molecules secreted from Hfstim-B cells in addition to IL-10 synergistically with cell-to-cell contact have a regulatory role on activation and function of DCs. Consequently; first, DCs were activated and secreted both pro-inflammatory and anti-infammatory cytokines in response to H. felis antigens in vitro. Second, Helicobacter felis-stimulated B cells converts immature BM-DCs into IL-10-secreting tolerogenic form. Therefore, this study includes comprehensive analysis for the effects of H. felis on mouse BM-DCs and the first investigation that clarifies the ex vivo interaction of Hfstim-B cells subgroups with BM-DCs.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    507149

    Expression profiling of Helicobacter-activated regulatory B cells

    Helicobacter-aktive regülatör B hücrelerinde gen ifadesinin belirlenmesi

    SAWSAN S.A. SAID

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  2. Tez No

    883352

    The impact of metabolic reprogramming in helicobacter-activated B cell survival, differentiation, and proliferation

    Metabolik yeniden programlamanın helikobakter ile aktive edilmiş B hücrelerinin canlılığına, farklılaşmasına ve çoğalmasına etkisi

    BAHAR DENİZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  3. Tez No

    421250

    Functional interactions between Helicobacter-activated B(HACT-B) cells and CD4+ T cells

    Helicobacter-aktive B(HAKT-B) hücrelerinin CD4+ T hücreleri ile fonksiyonel etkileşimleri

    GÜLİZ TUBA BARUT

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  4. Tez No

    421249

    The effect of Helicobacter felis on macrophage polarization

    Helicobacter felis'in makrofaj polarizasyonu üzerine etkisi

    ASLI KORKMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  5. Tez No

    165420

    Astımlı hastalarda Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori sıklığı ve hastalıkla ilişkisi

    Frequency of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori infections in asthma patients and their relationship with asthma

    ALİ ANNAGÜR

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2005

    Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıÇukurova Üniversitesi

    Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. SEVAL GÜNEŞER KENDİRLİ

Geri Dön