Geri Dön

Expression profiling of Helicobacter-activated regulatory B cells

Helicobacter-aktive regülatör B hücrelerinde gen ifadesinin belirlenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 507149
  2. Yazar: SAWSAN S.A. SAID
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Allerji ve İmmünoloji, Biyoloji, Genetik, Allergy and Immunology, Biology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 164

Özet

Bakteri, virüs, funguslar gibi yabancı organizmalara ve immün hücreleri tarafından yabancı olarak tanınan antijenlere karşı immün sistem ilk savunmayı sağlar. Vücudumuzdaki her an immün sistem bir çok farklı antijen ile karşılaşır. Bu nedenle, immün sistem bu farklılıkları ayırt etme yeteneğine ve uygun bir şekilde yanıt oluşturma yeteneğine sahiptir. Genel olarak immün sistem hücreleri, doğal ve sonradan kazanılan immün sistem altında yer alır. Doğal immün sistemin üyeleri olan hücreler, bir patojene karşı spesifik olmayan ilk yanıtı oluşturur ve çoğunlukla bu yanıt enflamasyona neden olur. Ayrıca, en önemli doğal immün sistem hücreleri lokal enfeksiyonlara hızlı bir şekilde yanıt veren nötrofiller ve makrofajlardır. Öte yandan, sonradan kazanılan immün sistem hücreleri, spesifik hücre yüzey markırlarına sahip olan T ve B hücrelerini içerir. Bu hücrelerin spesifik bir yabancı antijeni tanıması için belirli bir sürenin geçmesi gerekmektedir. Doğal ve sonradan kazanılmış immün sistem, Helicobacter gibi patojenlerin ortadan kaldırmak için bir düzen içinde çalışır. Helicobacter pylori (H. pylori) seçici olarak gastrik epitelde kolonize olan gram negatif bakteridir. H. pylori enfeksiyonu dünyadaki en yaygın bakteriyel enfeksiyondur. Dünya popülasyonunun yarısından fazlası, yaklaşık olarak yetişkin bireylerin %60'ı ve çocukların %30'u H. pylori ile enfekte durumdadır. Kesin kanıtlar, Helicobacter enfeksiyonunun bir defa kazanıldığında antimikrobiyal tedavi ile ortadan kaldırılmadıkça yaşam boyu devam ettiğini göstermektedir. H. pylori gastrik mukoza hücrelerinde lokalize olur. H. pylori ile enfekte tüm bireylerde genellikle semptom vermeyen kronik gastrik enflamasyon gözlenmektedir. Cag-PAI ve vacA gibi genlerinin varlığı gastrik atrofi, gastrik adenokarsinom gelişimi, konağın mukozal dokusunda aktive olan immün hücrelerin toplanması riskini arttırmaktadır. Ayrıca, yakin zamanda gerçekleştirilen bir calışmada H. pylori ile enfekte grubun H. pylori-negatif grup ile karşılaştırıldığında 1.7-5.3 kat daha fazla bağıl gastrik kanser riskine sahip oldugu gösterilmiştir. H. pylori'nin konak lenfositleri ve antijen sunan hücreler ile etkileşim mekanizması karmaşıktır. Bu nedenle, regülatör B ve T hücreleri immün patojenite ve koruma arasındaki denegenin kurulmasında önemli bir role sahiptir. Son zamanlarda, regülatör T hücrelerinin farelerdeki H.pylori ile indüklenen gastriti azalttığı gösterilmiştir. Aynı zamanda, regülatör T hücreleri bakterinin mukozada yüksek oranda kolonize olmasına da izin verir. Bununla beraber, enfekte bireylerde H. pylori-spesifik CD4+ CD25+ regülatör T hücreleri H. pylori'ye karşı gelişen hafıza T hücre cevabını baskılamaktadır. Ayrıca, Helicobacter ile ilişkili immün yanıtta regülatör B hücrelerinin rolü de araştırılmıştır. IL-10 üreten B hücreleri TLR-2/Myd88 yolağı aracılığıyla aktive olmaktadır. Bununla birlikte, IL-10 üreten B hücreleri, naif T hücrelerinin tip-1 regülatör T (Tr1) hücrelerine farklılaşmasına neden olmaktadır. Tr-1 ve IL-10 üreten B hücreleri arasındaki etkileşim, pre-kanseröz lezyonları xxx engelleyebilir ve Helicobacter'e karşı iyi bir immün düzenleyici olarak işlev görebilir. İlk olarak, laboratuvarımızdaki önceki çalışmalarda H. felis-stimüle (Hfstim) B hücrelerinin fenotipleri çalışılmıştır. Bu bağlamda, H. felis ile etkileşimin ardından iki Breg alt grubunun oluştuğu gösterilmiştir: Hfstim-IL-10+ B and Hfstim-IL-10– B hücreleri. Her iki hücre alt grubu farklı hücre yüzey markırları ve sitokin profilleri ile tanımlanmıştır. Ayrıca, Hfstim-IL-10+ B ve Hfstim-IL-10– B hücrelerinde tümör nekroz alfa (TNF-α) ve interlökin 6 (IL-6) sitokinleri araştırılmıştır. Hfstim-IL-10- B hücrelerinde, Hfstim-IL-10+ B hücreleri ile karşılaştırıldığında, TNF-α ve IL-6 sitokinleri mRNA ve protein düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı olarak eksprese edilmişir. Laboratuvarımızda gerçekleştirilen son zamanlardaki çalışmalar ve Müller'in elde ettiği veriler, bizi Hfstim-Breg'lerin naif CD4+ T hücreleri üzerindeki fonksiyonel rolünü araştırmaya teşvik etti. Buna ek olarak, son zamanlarda gerçekleştirilen çalışmalarda, RNA-seq ve mikroarray teknikleri aracılığıyla B10 hücrelerinin transkriptom analizleri yapılmıştır. LPS ile muamele edilmiş B10+ ve B10- hücrelerinde farklı düzeylerde eksprese edilen genler tanımlanmıştır. Bu çalışmamızda Hfstim-Breg'lerde son zamanlarda tanımlanmış genlerin ekspresyon düzeylerini araştırmayı amaçladık. İlginç bir şekilde, son tanımlanan genler CD9, STAT1, PDCD1(PD-1) ve NRP2'dir. Çalışmamızda stimüle edilmeyen B hücreleri, Hfstim-B hücreleri, Hfstim-IL-10+ B ve Hfstim-IL-10- B hücreleri olmak uzere 4 grup bulunmaktadir. Dolayısıyla, ilk olarak, mikroarray analizi ile Helicobacter ile stimüle edilen regülatör B hücrelerinin ekspresyon profilinin ortaya çıkarılmasına odaklandık. Daha sonra, IL-10 üreten regülatör B hücrelerinin gen ekspresyon profili, B hücrelerinin immün fonksiyonu ile ilişkili spesifik genleri ve transkripsiyon faktörlerini kodlayan genlere yönelik detaylı bir veri sağlayacaktı. Mikroarray verilerimiz, IL-10– B hücreleri ile karşılaştırıldığında IL-10+ B hücrelerinde 1615 genin ekspresyonunun artarken 794 genin ekspresyonunun azaldığını göstermektedir. Son zamanda çıkan bir çalışmada, IL-10+ B hücrelerinin CD9 ve PDCD1 genlerini yüksek düzeyde eksprese ettiklerini göstermiştir. Mikroarray ve gerçek zamanlı PZR verilerine dayanarak, iki diğer aday gen (S100A8 ve Trib1) ile beraber CD9, PDCD1 ve NRP2 genlerinin Hfstim-IL-10+ B ve Hfstim-IL-10– B hücrelerinde farklı ekspresyonlara sahip olduğunu saptadık. Daha sonra, Hf stim-IL-10+ and Hfstim-IL-10– B hücrelerinde PD-1 ve CD9 molekülleri protein düzeyinde akan hücre ölçer analizi ile araştırılmıştır. PD-1 ve CD9 protein düzeyleri, Hfstim-IL-10+ B hücrelerinde Hfstim-IL-10– B hücreleri ile karşılaştırıldığında anlamlı bir şekilde daha yüksek gözlenmiştir. Bununla birlikte, Hfstim-IL-10+ Breg'lerde PDCD1 ekspresyonunun doğrulanması bizim ikinci amacımızdı. Bu bağlamda, B hücrelerinde ekspresyonu artan PD-1'in PD-1/PDL1 etkileşimi ile Tr1 indüklenmesindeki rolünün anlaşılabilmesi ile ilişkili PD-1 için fonksiyonel çalışmalar, PD1/PD-L1 etkileşiminin bloke edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Akan hücre ölçer analizleri; CD9, CD19, IL-10, PD-L1, and PD-L2 molekülleri için gerçekleştirilmiştir. PD-1 ve ligandı PD-L1 Hfstim-IL-10+ B hücrelerinde Hfstim-IL-10– B hücrelerine göre daha yüksek düzeylerde eksprese edilmektedir. Bu bağlamda, B hücre ve naif CD4+ T hücre ko-kültüründen önce Hfstim- IL-10+ B veya Hfstim-IL-10– B hücrelerinde PD-1 veya PD-L1 bloke edilmiştir. PD-1/PDL-1 yolağının bloke edilmesi için anti-PD-1 veya anti-PD-L1 kullanılmıştır. PD-1 molekülü bloke edilen Hfstim-IL10+ B hücrelerinde, PD-1 molekülü bloke edilen Hfstim-IL10– B hücrelerine göre daha düşük oranda IL-10+ CD4+ T hücrelerini indüklemiştir. PD-1/PD-L1 yolağının bloke xxxi edilmesinin ardından IL-10'un CD4+ T hücrelerinde ekspresyonunun azalması, PD-1+ B hücrelerinin Tr1 gelişimindeki rolünü vurgulamaktadır. Önceki çalışmalar PD-1+ CD4+ T hücrelerinin IL-10 üreten T hücrelerinin gelişimini etkilediğini göstermiştir. Çalısmamızda, naif CD4+ T hücrelerinde PD-1 ve PD-L1 ekspresyonlarını gösterdik. Dolayısıyla, PD-1+ CD4+ T veya PD-L1+CD4+ T hücrelerinin Breg'ler ile etkileşimi süresince Tr1 hücrelerinin gelişiminin araştırılması amacıyla, Hfstim-IL-10+ B / Hfstim-IL-10– B hücreleriyle ko-kültürden önce CD4+ T hücrelerinde PD-1 veya PD-L1 molekülleri bloke edildi. Bu aşamada, Breg'ler ile ko-kültürün öncesinde CD4+ T hücrelerinde PD-L1 molekülünün bloke edilmesi, indirekt olarak Breg'lerde PD-1 molekülünün bloke edilmesiyle gerçekleştirildi. İlginç bir şekilde, Hfstim-IL-10+ B hücrelerinde PD-1'in veya CD4+ T hücrelerinde PD-L1'in bloke edilmesi, benzer bir şekilde CD4+ T hücrelerinde IL-10 ekspresyonunun azalmasına neden olmuştur.Bütün bu veriler ile Hfstim-PD-1+ Breg'lerin Tr1 hücrelerinin indüklenmesinde potansiyel bir role sahip olduğunu gösterdik. Aynı zamanda, naif CD4+ T hücrelerinin Hfstim-PD-1+ Breg'ler ile etkileşimi süresince gerçekleştirilen PD-1/PD-L1 blokağı, bozulmuş bir immün yanıta olanak vermiştir. Gerçekten, immün yanıtı güçlendirmek ve Helicobacter ile induklenen gastrik kanserin ilerlemesinin engellenmesi için PD-1+ Breg hücreleri, terapötik bir hedef olarak kullanılabilir. Şu anda, PD-1 ekspresyonu H. pylori ile enfekte hastaların özellikle CD4+ T hücrelerinde gösterilmiştir. Ayrıca, H. pylori yoğunluğu ile CD4+ PD-1+ T hucre veya CD4+ CD25hi Treg sıklığı arasında anlamlı ilişki de gösterilmiştir. Bu nedenle, Helicobacter ile enfekte gastrik dokuda PD-1 mRNA ekspresyonu konusunda çalışmalar yaptık. Bu çalışmalarda, gastrik dokunun H. pylori ile enfeksiyon durumu daha önceden laboratuvarımızda üre A ve üre B gerçek zamanlı PZR yöntemi ile doğrulanmıştır. Dolayısıyla, H. pylori-negatif bireylerde ve H. pylori ile enfekte gastrit ve ülser hastalarında gerçek zamanlı PZR aracılığıyla PD-1 ekspresyon düzeylerini belirledik. İnsan PD-1 mRNA düzeylerinin H. pylori ile gastrik dokuda farklı bir şekilde eksprese edildiğini gösterdik. Ülser hastalarında, gastrit hastaları ile karşılaştırıldığında anlamlı bir PD-1 mRNA ekspresyonu gözlenmiştir. Bu veriler, H. pylori ile enfekte gastrik dokuda insan PD-1 molekülü ile ilgili bir ön çalışma niteliğindedir. Laboratuvarımızdaki gelecek çalışmalar H pylori ile enfekte bireylerin gastrik dokularinda PD-1 ile IL-10 üreten B hücreleri veya IL-10 üreten T hücreleri arasındaki ilişkiyi araştıracaktır.

Özet (Çeviri)

The immune system provides the primary defense against the invasion of foreign organisms including; bacteria, viruses, fungi or any antigen recognized as a foreign antigen by immune cells. Every moment inside our bodies, the immune system encounters many antigens around it. For that reason, the immune system should discriminate the non-self pathogens from self-antigens and respond appropriately. Broadly, the immune system is divided into innate and adaptive arms. The innate immune cells are the early line of defense in front of any pathogen in a nonspecific manner and they proceed to an inflammation. In addition, the most important innate immune cells are neutrophils and macrophages, which are responding quickly to local infection. On the other hand, the adaptive immune cells are T- and B- lymphocytes, both have specific cell surface markers, and mainly take time to recognize the specific foreign antigen. The innate and adaptive immune system often work in harmony to remove pathogens or foreign invaders. Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative bacterium that selectively colonizes the gastric epithelium and is the most common bacterial infection worldwide. More than 50% of the world's population are H. pylori infected. Approximately, 60% of adults and 30% of children. Clear evidence indicates that once the Helicobacter infection is acquired, it usually persists for lifelong unless it is eradicated by antimicrobial therapy. H. pylori is located in gastric mucosal cells. All of the H. pylori-infected patients mainly develop asymptomatic chronic gastric inflammation. The presence of genes such as Cag pathogenicity island (cag-PAI) and vacuolating cytotoxin A (vacA) that increases the risk for gastric atrophy, gastric adenocarcinoma development, recruitment and activation of immune cells in the underlying mucosal host tissue. The present study reported that the relative risk of gastric cancer is 1.7-5.3 times higher in H. pylori - infected individuals compared to uninfected individuals. The mechanism of interaction between H. pylori and host lymphocytes as well as antigen presenting cells is complicated. Therefore, the regulatory B and T cells have a pivotal role in the balance between immune pathogenicity and protection. Recently, it has been shown that the regulatory T cells could reduce H. pylori-induced gastritis in mice. At the same time, the regulatory T cells allow the bacterium to colonize the mucosa at higher densities. In addition, H. pylori-specific CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress memory T-cell responses against H. pylori in infected humans. In addition to that, the role of regulatory B cells in Helicobacter - driven immune response was investigated. It was reported that IL-10- producing B cells were activated upon Helicobacter infection. The IL-10- producing B cells were activated through Toll-Like Receptor 2 (TLR-2)-myeloid differentiation primary-response protein 88 (MyD88) signaling. In fact, the IL-10- producing B cells lead to differentiation of T regulatory-1 (Tr-1) cells from naive T cells. The interaction xxvi between Tr-1 and IL-10-producing B cells may prevent the gastric precancerous lesions and serve as a good immune modulator against Helicobacter. While phenotype of H. felis stimulated (Hfstim) B cells were investigated two H. felis induced Breg subsets were determined; Hfstim-IL-10+ B and Hfstim-IL-10– B cells. Both subsets were identified with various surface markers and cytokine profiles. Hfstim-IL-10+ B cells (CD1d+CD5+ CD21+CD23+) and produce IL-10, and Hfstim-IL-10– B cells (CD21+CD23lo) and produce IgM, IgG2b and TGF-β. Furthermore, we assessed the level of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 6 (IL-6) in Hfstim-IL-10+ B and in Hfstim-IL-10– B cells. Both the m RNA and protein levels of TNF-α and IL-6 cytokines are expressed significantly higher in Hfstim-IL-10– B cells compared to Hfstim-IL-10+ B. Based on ours and others findings, we aimed to identify the functional role of Hfstim-Bregs upon interaction with naive CD4+ T cells. Previous studies showed the transcriptome profile of B10 cells by using RNA-Seq and microarray analysis. In our study, we aimed to investigate the expression profile of Helicobacter - stimulated regulatory B cells (Hfstim-Bregs) by microarray analysis. Our samples include four groups; unstimulated B cells, Hfstim-total B cells, Hfstim-IL-10+ B and Hfstim-IL-10– B cells. Our microarray data indicated that 1615 genes are up-regulated and 794 genes are down–regulated in Hf stim- IL-10+ B cells compared to Hf stim- IL-10– B cells. CD9 and PDCD1 were shown to be highly expressed in IL-10+ B cells by a recent publication. Based on our microarray and real -time PCR data, we found differential expression of CD9, PDCD1, and NRP2 together with two other candidate genes (S100A8 and Trib1) in Hfstim-IL-10+ B cells in comparing to Hfstim-IL-10– B cells. Afterward, the surface expression of PD-1 and CD9 was investigated by flow cytometry analysis in Hfstim-IL-10+ B and Hfstim-IL-10– B cells. The PD-1 and CD9 protein levels are significantly high in Hfstim-IL-10+ B cells compared to Hfstim-IL-10– B cells. Of note Of noteOf note , both q-RT-PCR results and flow analysis confirmed the expression of PD-1 in Hfstim-IL-10+ B cells. Accordingly, we pointed out to identify the functional implication of a PDCD1 in Helicobacter stimulated Bregs. The flow cytometric analysis is applied to assess CD9, PD-1, CD19, CD4, IL-10, PD-L1, and PD-L2 expression on B cell groups. In line with the previous reports, we found high expression of PD-1 in mRNA and protein level in Hf stim-IL-10+ B cells. While, there was a distinct surface expression of PD-L1 in Hf stim-IL-10– B cells compared to Hf stim-IL-10+ B cells. Besides the m RNA level of PD-L1 was high in Hf stim-IL-10+ B cells compared to Hf stim-IL-10– B cells. In this regard, we blocked PD-1 or PD-L1 in Hfstim-IL-10+ B or in Hfstim-IL-10– B cells prior to co-culturing B cells with naive CD4+ T cells. The anti PD-1 or anti PD-L1was used to block the PD-1-PD-L1 axis pathway. Remarkably, blockade of PD-1 or PD-L1 in Hfstim-IL-10+ B cells led to a pronounced down regulation of IL-10+ CD4+ Tr1 cell differentiation. Interestingly, blockade of PD-1 or PD-L1 on CD4+ T cell prior to co-culturing with Hfstim-IL-10+ B / Hfstim-IL-10– B cells also decrease the percentage of Tr1 differentiated cells. Therefore, PD-1/ PD-L1 interaction between B and T cells is important in inducing Tr-1 cell differentiation. Also, the Hfstim-PD-1+ Bregs have a potential role in inducing Tr1 cells. Furthermore, the PD-1+ Bregs could be used, in future, as a therapeutic target to provoke the immune response and prevent the progression of gastric cancer. Currently, it was reported that PD-1 expression was high in CD4+ T cells of H. pylori infected patients. Notably, they found a significant correlation between H. pylori xxvii density with CD4+ PD-1+ T cell frequency or CD4+ CD25hi Tregs. Therefore, we studied PD-1 mRNA expression in Helicobacter-infected gastric tissue. H. pylori infection status of gastric tissue in this study was confirmed previously using ure A and ure B qPCR. Here, we determined the expression levels of PD-1 in gastric tissue of H. pylori negative individuals and in H. pylori infected gastritis and ulcer patients. The PD-1 mRNA is expressed significantly higher in ulcers compared to gastritis. Further studies would be performed to investigate the correlation between the human PD-1 in H. pylori infected gastric tissue with the IL-10- producing B cells or IL-10- producing T cells.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    883361

    Investigation of the energy metabolism of helicobacter-activated B cells

    Helikobakter ile aktive edilmiş B hücrelerinin enerji metabolizmasının araştırılması

    MEHMET ÇALÇI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. AYÇA SAYI YAZGAN

  2. Tez No

    421249

    The effect of Helicobacter felis on macrophage polarization

    Helicobacter felis'in makrofaj polarizasyonu üzerine etkisi

    ASLI KORKMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  3. Tez No

    450908

    The role of chemerin in Helicobacter pylori induced gastric pathogenesis

    Helicobacter pylori ile indüklenen gastrik patogenezde kemerinin rolü

    MANTASHA TABASSUM

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  4. Tez No

    244931

    The analysis of Wnt pathway in gastric cancer

    Mide kanserinde Wnt sinyal yolunun analizi

    GÜRKAN ŞEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    OnkolojiFatih Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. MELİHA BURCU IRMAK YAZICIOĞLU

  5. Tez No

    575438

    Helicobacter pylorı ve epstein barr virüsü ilişkili gastrik karsinomların P73 ekspresyon profili ve klinikopatolojik parametrelerle ilişkisi

    The relationship between helicobacter pylori and epstein barr virus-associated gastric carcinomas with P73 expression profile and clinicopathological parameters

    BURCU GÜL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Moleküler TıpBezm-i Alem Vakıf Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEMRA ÖZÇELİK

Geri Dön