Cloning of Taql endonuclease gene into E.coli and its expression
Taql endonükleaz geninin E.coli'ye klonlanması ve ekspresyonu
- Tez No: 50457
- Danışmanlar: PROF.DR. BETÜL KIRDAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1996
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 70
Özet
ÖZET TaqI endonükleaz kromozom yapısının incelenmesinde, çok uzun DNA moleküllerinin dizi analizinde, genlerin ayrılmasında ve yeni DNA moleküllerinin oluşturulmasında sıklıkla kullanılan bir enzimdir. Bu enzim ilk olarak Thermits aquaticus YT1' dan elde edilmiştir. Fakat bu organizmanın büyütülmesi ve TaqI endonükleazm saflaştırılması zor ve pahalıdır. Dolayısıyla bu enzimi kodlayan genin klonlanması ve bu endonükleazı hızlı ve etkili bir saflaştırabilecek yöntem ve yaklaşımlar geliştirilmesi çok önemlidir. Bu çalışma kapsamında, TaqI endonüklez enzimini çok miktarda üretmek ve tek bir aşamada saflaştırmak amacıyla, TaqI endonükleaz geni Thermits aquaticus' tan E. colV pMAL-c2 vektörü kullanılarak klordandı. Bu çalışmanın ilk bölümünde, TaqI endonükleazı kodlayan bölge PCR reaksiyonu ile çoğaltıldı. Bu bölgeye özgü primer dizileri yapay endonükleaz tanıma bölgesi taşıyacak şekilde tasarlandı. Çoğaltılan ürünün bu özelliği kullanılarak pMAL-c2 vektörüne yerleştirildi ve böylece oluşturulmuş yapı E. coli hücrelerine elektroporasyon tekniği kullanılarak aktarıldı. Elektroporasyon işleminden sonra hücreler içinde ampisilin bulunan agar tabaklarına yayıldı. Rekombinant hücreler a-komplemantasyon testi ve hücre çatlatma yötemleriyle tarandı. Orijinal vektörden büyük boyda plazmidleri taşıyan koloniler restrksiyon enzimleri ile test edildi. Dört koloninin doğru rekombinant plazmidi taşıdıkları bulunmuştur. İkinci bölümde, tahmin edilen boyda bir füzyon proteinin bu kolonilerde sentezlendiği gözlendi. Hücre özütleri ısı veya affinite kolonu ile kısmen saflaştınldı ve zenginleştirilen füzyon proteinin TaqI aktivitesi test edildi. Bu örneklerde TaqI aktivetisinin bulunmamasının füzyon proteinin MBP bölümünden kaynaklanabileceği düşünülerek bu parçanın kesilmesine karar verildi. 16 numaralı koloninin füzyon proteini faktör Xa ile kesildi ve doğal TaqI endonükleazm elde edilmesi sağlandı.
Özet (Çeviri)
IV ABSTRACT TaqI endonuclease is a widely used enzyme in analyzing chromosome structure, sequencing very long DNA molecules, isolating genes, and creating new DNA molecules that can be cloned. This enzyme is originally purified from Thermus aquaticus YT1. Growth of this organism and purification procedures that are needed to isolate TaqI endonuclease are very complicated and costly. Therefore, cloning and development of a rapid and efficient way of purification for this endonuclease is very important. In the frame work of this thesis, the aim was to overproduce and purify the TaqI endonuclease using a single step purification ptotocol, we have cloned the TaqI endonuclease gene form Thermus aquaticus into E. coli by using pMAL-c2 vector. In the first part of this study, the coding region of the TaqI endonuclease gene was amplified by PCR. Primers which are specific to the region were specifically designed to contain artificial endonuclease recognition sites. Using these property, the amplified product was inserted into the pMAL-c2 vector and competent E.coli cells were transformed by electroporation technique. The electroporated cells were spread onto ampicillin containing plates. The transformant cells were screened by a-complementation test, then the selected candidate colonies were analyzed by cracking method. The colonies that harbor a plasmid size greater than the original pMAL-c2 vector were tested with restriction enzymes. Four colonies were found to be harboring a correct recombinant plasmid. In the second part, it was found that a fusion protein of expected size was synthesized by the four colonies selected in the first part of the study. The fusion protein was enriched by partial purification of the cell extract either by heat treatment or affinity chromatography. It was observed that the partially purified samples did not have the desired TaqI activity. Since the MPB part of the fusion protein may affect the activity of the fusion in a negative way, MBP part of the fusion protein of the colony 16 was removed by factor Xa digestion and analysis of the digested protein on SDS-PAGE showed that a protein which have a molecular size close to the native TaqI endonuclease was produced.
Benzer Tezler
- Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli
TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu
ELİF ÖZKIRIMLI
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF.DR. BETÜL KIRDAR
- Cloning and expression of TagI endonuclease in E.coli by using the cloning vector pUC18
TaqI endonükleazının pUC18 klonlama vektörü kullanılarak E.coli'ye klonlanması ve üretimi
ZEYNEP PETEK ÇAKAR
Yüksek Lisans
İngilizce
1996
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiPROF.DR. BETÜL KIRDAR
PROF.DR. ZEYNEP İLSEN ÖNSAN
- Bacillus subtilis'e ait selülaz genlerinin e.coli'de klonlanması
Cloning of Bacillus subtilis cellulase genes in e.coli
BAHRİ DEVRİM ÖZCAN
- Cloning of AtBOR4 gene to Medicago sativa L. (Leguminosa-Fabecea) to generate boron tolerant plant cultivar
AtBOR4 geninin bora karşı dirençli Medicago sativa L. geliştirilmesi amaçlı klonlanması
HÜSEYİN TOMBULOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
BiyolojiFatih ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. M.SERDAL SAKÇALI
YRD. DOÇ. DR. FAHRİ AKBAŞ
- Domates fw2.2 verim geninin buğday ortologlarının klonlanması ve önemli buğday çeşitlerinin genomik ve fonksiyonel genomik bazında fw2.2 buğday ortologu ile taranması
Cloning of wheat orthologous of tomato fw2.2 yield gene and genomic and functional genomic analysis of wheat varieties by fw2.2 wheat orthologous
EMRE İLHAN
