Geri Dön

Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli

TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 76483
  2. Yazar: ELİF ÖZKIRIMLI
  3. Danışmanlar: PROF.DR. BETÜL KIRDAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 1998
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 126

Özet

Thermus aquaticus'un ısılkararlı Taql restriksiyon endonükleazı yüksek miktarda üretim ve tek aşamalı afinite kromatografisi ile saflaştırma için Escherichia coliye klordandı. Gen, pMAL-c2 vektörüne klonlanmış ve MBP-Taql restriksiyon endoükleaz füzyon proteinin sitoplazmik ekspresyonu sağlandı. Bu çalışmanın ilk aşamasında Thermus aquaticus DNA'sındaki Taql restriksiyon endonükleaz geni Taq DNA polimeraz kullanılarak PCR metodu ile çoğaltıldı ve Escherichia coli'ye klonlandı. Doğru boyda füzyon proteininin yüksek miktarda üretilmesine karşın, endonükleaz aktivitesi elde edilemedi. Ortam koşullarının değiştirilmesi ve değişik Escherichia coli suşlannda ekspresyon sonucunda da aktif restriksiyon endonükleazı elde üretilemedi. Bunun üzerine, genin dizi analizi yapıldı ve 410uncu baz çiftinde aktiviteye engel olabilecek bir mütasyon saptandı. Çalışmanın ikinci aşamasında Taql restriksiyon enonükleaz geni Pfu DNA polimeraz kullanılarak çoğaltıldı. Doğru boy ve aktivitede füzyon proteini üreten bir koloni seçildi. İndükleme zamanının optimizasyonu sonucunda kültürün abzorbansı 0.9'a ulaşınca yapılan indüksiyon sonucunda daha yüksek restriksiyon endonükleaz aktivitesi elde edildiği belirlendi. TBI, XL 1 -Blue ve ER2508 adlarındaki üç değişik Escherichia coli susunda ekspresyon sonucunda 1 litre TBI hücre kültüründen 300,000 Ünite enzim aktivitesi elde edilirken. 1 litre XL 1 -Blue hücre kültüründen 100,000 Ünite enzim aktivitesi ve 1 litre ER2508 hücre kültüründen 150,000 Ünite enzim aktivitesi elde edildi.

Özet (Çeviri)

The thermostable TaqI restriction endonuclease from Thermus aquaticus was cloned into Escherichia coli for overproduction and single step affinity chromatography purification. The gene was cloned into pMAL-c2 vector, resulting in the cytoplasmic expression of a MBP-Taql restriction endonuclease fusion protein. In the first part of this study, TaqI restriction endonuclease gene was amplified using Taq DNA polymerase and cloned into E. coli. Although the expected size fusion protein was produced, no endonuclease activity was obtained. Growth condition manipulations and expression in different strains did not result in the production of an active enzyme. Subsequent sequencing of the gene indicated a mutation at position 410 that might abolish activity. In the second part, cloning was repeated after amplification of the gene with Pfu DNA polymerase which has proofreading activity. A colony coding for a protein with the expected size and activity was identified. Upon optimization of induction time, higher tiled was obtained when the culture was induced at an absorbance of 0.9. Expression in three different strains of E. coli, indicated total recovery was higher in TBI cells at 300,000 Units/liter of culture volume as compared to 100,000 Units/liter in XL 1 -Blue cells and 150,000 Units/liter in ER2508 cells.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    50542

    Cloning of TaqI endonuclease gene into E.coli and isolation of the enzyme by using pMAL-p2 vector system

    pMAL-p2 vektör sistemi kullanılarak TaqI restriksiyon enzim geninin E.coli'ye klonlanması ve enzimin izolasyonu

    PEMBE HANDE ÖZDİNLER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1996

    BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF.DR. BETÜL KIRDAR

  2. Tez No

    50457

    Cloning of Taql endonuclease gene into E.coli and its expression

    Taql endonükleaz geninin E.coli'ye klonlanması ve ekspresyonu

    İZZET ENÜNLÜ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1996

    BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF.DR. BETÜL KIRDAR

  3. Tez No

    50512

    Cloning and expression of TagI endonuclease in E.coli by using the cloning vector pUC18

    TaqI endonükleazının pUC18 klonlama vektörü kullanılarak E.coli'ye klonlanması ve üretimi

    ZEYNEP PETEK ÇAKAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1996

    Kimya MühendisliğiBoğaziçi Üniversitesi

    PROF.DR. BETÜL KIRDAR

    PROF.DR. ZEYNEP İLSEN ÖNSAN

  4. Tez No

    352020

    Anoxybacillus flavithermus bakterisinin ısıl kararlı guanozintrifosfat siklohidrolaz-I geninin klonlanması ve ekspresyonu

    Cloning and expression of guanosintriphosphate cyclohydrolase-I from anoxybacillus flavithermus

    ÖZLEM HIZAL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    BiyoteknolojiRecep Tayyip Erdoğan Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. FATİH Ş. BERİŞ

  5. Tez No

    355375

    ATP-bağımlı ftsH geninin Geobacillus kaustophilus'dan klonlanması ve ekspresyonu

    Cloning and expression of ATP-dependent ftsH gene from Geobacillus kaustophilus

    AHMET TÜLEK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. FATMA İNCİ ÖZDEMİR

Geri Dön