Geri Dön

Investigation of the energy metabolism of helicobacter-activated B cells

Helikobakter ile aktive edilmiş B hücrelerinin enerji metabolizmasının araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 883361
  2. Yazar: MEHMET ÇALÇI
  3. Danışmanlar: PROF. AYÇA SAYI YAZGAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Allerji ve İmmünoloji, Biyokimya, Biyoloji, Allergy and Immunology, Biochemistry, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 76

Özet

Helikobakter pilori , gram negatif, spiral şekilli ve mikroaerofilik bir bakteridir. Mide kanseri oluşumuna neden olduğundan dolayı Dünya Sağlık Örgütü tarafından tip 1 karsinojen olarak ilan edilmiştir. Dünya nüfusunun yüzde 50'sinden fazlası bu bakteri ile enfektedir ancak sadece yüzde 10-20'lik kısımda ciddi gastrointestinal hastalıklar gözlenmektedir. H.pilori, farelerde immün yanıt oluşturamadığı için fare hastalık modellerinin oluşturulmasında H.pilori ile aynı aileden gelen H.felis kullanılmaktadır. Bağışıklık sistemi, herhangi bir bulaşıcı hastalığa karşı savunma ve koruma sistemidir. Doğuştan gelen ve sonradan kazanılmış olmak üzere iki grupta incelenmektedir. Mikroplara karşı erken savunma hattı, doğuştan gelen bağışıklık tarafından oluşturulmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık, enfeksiyondan önce bile mevcut olan ve enfeksiyonlara hemen yanıt vermeye hazır olan hem hücresel hem de biyokimyasal savunma mekanizmalarını içerir. Sonradan kazanılmış bağışıklık ise organizmanın enfeksiyon ajanı ile karşılaşması durumunda aktif hale gelir. Hafıza yanıt oluşması sonradan kazanılmış bağışıklığın en temel özelliklerinden biridir. B hücreleri, antikor üretimi ve antijen sunumu özellikleri nedeniyle immün yanıtın düzenlenmesi sırasında önemli rol oynar. B hücrelerinin düzenleyici rolü, otoimmün ensefalitin üstesinden gelemeyen B hücrelerinden yoksun farelerin kullanılmasıyla gösterilmiştir. Helicobacter felis, TLR2 ve Myd88 yoluyla B hücrelerini uyarır ve bağışıklık tepkilerini bastırır. Bu baskılama, bakterilerin mide mukozasında kalıcılığını sağlar. Bu nedenle, düzenleyici ve efektör yanıt arasındaki denge, enfeksiyonun durumunu belirleyebilir. Daha önceki laboratuvar çalışmalarımızda gösterildiği gibi, B hücrelerinin H. felis aracılı aktivasyonu iki farklı B hücresi alt grubunu indükler: IL-10 üreten IL-10+ B hücreleri ve TGF-β üreten IL-10-B hücreleri. Dinlenme durumundaki bir bağışıklık hücresi antijenle karşılaştığında metabolik yönden yeniden programlanma geçirir. Bağışıklık hücrelerinin enerji üretimi için sahip olduğu metabolik profil, bağışıklık sisteminin düzenlenmesinde önemli bir yere sahiptir. Bağışıklık hücrelerinin proliferasyon geçirip efektör bir hücreye dönüşmesi sırasında ihtiyacı olan enerji (ATP) üretim mekanizması hücreden hücreye farklılık göstermektedir. ATP üretiminde temel olarak kullanılan biyomoleküllerden glikoz, hücre içine glikoz taşıyıcıları (GLUT) ile alınarak glikolize katılır. Glikoliz sonunda oluşan pürivat oksijen varlığında mitokondriye geçip TCA döngüsüne girerek oksidatif fosforilasyonu arttırabileceği gibi gibi sitoplazmada kalıp laktata da dönüşebilir. Oksidatif fosforilasyon yolağı aynı zamanda yağ asitleri ve aminoasitleri de kullanabilmektedir. Glikoliz daha az ATP üretimi ile sonuçlansa da daha kısa sürede hücreye enerji sağladığı için bazı hücreler, özellikle tümör oluşumu sırasında ortamda oksijen yeterli olsa dahi glikoliz ile hızlı bir şekilde ATP üretimine devam edip yoğun miktarda laktat üretirler., oksidatif fosforilasyonu tercih etmezler. Buna Warburg etkisi denilmektedir. Oxfos sonrasında hücre içinde yoğun olarak ROT (reaktif oksijen türleri) oluşur ve bazı durumlarda oluşan ROT mutasyona sebep olabilir. Glikoliz ve oksidatif fosforilasyon hücrede enerji üretimi için görev alan ik temel yolaktır.Glikoliz inhibitörü olan 2-DG ile muamele edilen LPS ile uyarılmış B hücrelerinin proliferasyonlarında azalma olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Buna ek olarak B hücrelerinin anti CD-40 ve IL-4 ile uyarımı sırasında ATP sentaz inhibitörü olan oligomisin ile muamelesinin aktivasyon belirteci olan CD86'yı ve hücre canlılığını azalltığı rapor edilmiştir. Ancak B hücrelerinin Helikobakter aracılığıyla uyarıldığında metabolik olarak nasıl yeniden programlama geçirdiğinin bilgisi literatürde bulunmamaktadır. Hücre kültüründe uyarı almayan B hücreleri canlılıklarını uzun zamanlı sürdürememektedir. Yapılan bir çalışmada B hücrelerine düşük doz ilave edilen recombinant B hücre aktive eden faktör (rBAFF) hücrelerin canlılığını arttırmıştır. Bu bilgilerden hareketle rBAFF 'ın Helikobakter- active B hücresi canlılığı ve fonksiyonu üzerine etkisini araştırmak hedeflendi. Çünkü devamında gerçekleşecek olan metabolik analiz çalışmalarında hücre canlılığı oldukça kritikti. C57BL/6 fare dalağından manyetik ayırım ile izole edilen B hücreleri H.felis sonikatı, PAM3CSK4 ve LPS ile 6 ve 24 saat uyarılmıştır. 6 saat diliminin seçilmesindeki temel amaç hücrelerin henüz proliferasyona uğramadan yalnızca uyaran varlığında nasıl bir yanıt oluşturduklarını araştırmak, 24 saat dilimin seçilmesindeki temel neden ise B hücrelerinin anti-inflammatuvar sitokin olan IL-10'i salgılamaya başlamasıdır. B hücrelerinin kültür ortamında canlılığını arttırmak amacıyla düşük dozda eklenen rBAFF'ın canlılık üzerine etkisi akan hücre ölçer cihazı ile, fonksiyon üzerine etkisi CD86 ve CD9 yüzey belirteçlerinin ekspresyon seviyeleri ile yine akan hücre ölçer cihazında, IL-10 seviyesine etkisi ise IL-10 ELIZA yöntemi ile araştırılmıştır. Hücreler Il-10 üretimine anlamlı olarak başlamasa da 24 saat diliminde uyarı alan gruplar yüksek oranda IL-10 üretmeye başlarlar. B hücre kültür ortamına eklenen rBAFF, özellikle uyarı almayan kontrol grubu canlılığını anlamlı bir şekilde arttırsa bile hücrelerin IL-10 seviyelerini değiştirdiği için metabolizma çalışmalarının sonuçlarını etkileyeceğinden dolayı deney planından çıkarılmıştır. Çünkü rBAFF'ın B hücresi canlılığını arttırıken fonksiyonu üzerine herhangi bir etki göstermemesi durumunda metabolizma çalışmalarında özellikle uyarı almayan kontrol grubuna verilmesi amaçlanmıştır ancak B hücrelerinin IL-10 üretim seviyelerini az da olsa değiştirdiğinden rBAFF deney gruplarına verilmemiştir. Çalışmadaki diğer amaç ise H.felis ile uyarılmış dalak B hücrelerinin metabolik profilinin nasıl karakterize olduğunu araştırmaktır. Dinlenme durumundan uyarana maruz kalarak efektör bir hale geçerken gereken enerji üretimi için hangi yolakları aktifleştirdiği metabolik akış analiz yöntemi ile araştırılmıştır. B hücreleri H.felis sonikatı, PAM3CSK4 ve LPS ile 6 ve 24 saat boyunca kültürde tutulmuş daha sonra da enerji metabolizmalarındaki değişim hücredışı akış analizi yöntemi ile XFe96 cihazında ölçülmüştür. Ölü hücre sayısının yüzde 20'yi geçmesi metabolizma çalışmalarının sonuçlarını olumsuz etkileyeceğinden dolayı özellikle kontrol gruplarında manyetik ayırım yöntemi ile ölü hücre uzaklaştırma işlemi yapılmıştır. Sadece canlılığı yüksek olan hücreler metabolizma çalışmalarına dahil edilmiştir. Uyarı almayan gruplardaki canlı hücre oranı, ölü hücrelerin manyetik olarak uzaklaştırılmasından sonra %50 'den % 80'e kadar çıkmıştır. Öncelikle ölü hücre ayrımı sırasında kullanılan kitin hücre metabolizması üzerinde herhangi bir etki yapıp yapmadığını anlamak için çok küçük bir grupta karşılaştırmalı olarak metabolik veriler ölçülmüş ve bu kitin metabolizma üzerinde bir etkisi olmadığı gösterilmiştir. Bu yöntemdeki tek amaç ölü hücrelerin ortamdan uzaklaştırılması ve metabolizma ölçümünün sadece canlı gruplarda yapılması ve veri doğruluğunun arttırılmasıdır.Uyarı alan gruplarda canlılık verisi metabolizma deneylerini yapmaya uygun olduğundan bu gruplara ölü hücre ayrımı yapılmamıştır. Çalışmamızdan elde edilen sonuçlara göre ilk olarak B hücrelerinin 6 ve 24 saat boyunca H.felis sonikatı, PAM3CSK4 ve LPS ile uyarılması sırasında hücre kültürüne eklenen baff, özellikle uyarı alan gruplarda uzun süreli stimulasyonda canlılığı anlamlı bir şekikde arttırmıştır. Ortama eklenen baff B hücreleri tarafından üretilen Il-10 miktarını da etkilediğinden B hücre fonksiyonunu az da olsa değiştirmiştir. Bu fonksiyon değişikliği metabolizma çalışmalarını da etkileyeceğinden dolayı baff deney gruplarından çıkarıtldı. CD-86 ve CD-9 yüzey belirteçlerine bakıldığında ise baff eklenmesi anlamlı bir değişikliğe yol açmamıştır. İkinci olarak yapılan metabolizma çalışmalarında glikoliz ve glikolitik kapasite ölçülen ECAR verileri doğrultusunda anlamlı bir şekilde artış eğilimindedir. 6 saatte de uyarı alan gruplar uyarı almayan kontrol gruplarına göre hem glikolizi hem de glikolitik kapasiteyi arttırmış olsa da 24 saat stimulasyon ile kıyaslanırsa bu oran çok daha azdır. Hücrelerin bazal ve maksimum OCR değerleri oxfos sırasında tükettikleri oksijen miktarı ile doğru orantılıdır. B hücrelerinin 24 saat boyunca H.felis sonikatı, PAM3CSK4 ve LPS ile uyarılması sonucunda hem basal hem de maksimum OCR değerleri uyarı almayan gruplara göre anlamlı bir şekilde artmıştır. Bu artış oranı 6 saat uyarı gruplarında çok daha azdır. Bunun nedeni ise B hücrelerinin farklılaşmaya başlaması için 6 saatin oldukça kısa bir zaman dilimi olmasıdır. Bu zaman diliminde asıl almak istediğimiz bilgi ise uyaranların metabolizma üzerindeki etkilerini anlamaktı çünkü farklılaşma sırasında da metabolik değişimler gözleneceğinden farklılaşma olmadan sadece uyaranların B hücre metabolizması üzerine etkilerini aydınlatabilmek amacıyla kısa süreli uyarı durumunda da hem ECAR hem de OCR ölçümleri alınarak gerek glikoliz gerek de oxfos hakkında bir veriye ulaşıldı. OCR verisi aynı zamanda hücrelerin mitokondriyal ATP üretimleri hakkında da bilgi vermektedir. H.felis sonikatı, PAM3CSK4 ve LPS ile uyarılan B hücreleri 24 saat sonunda mitokondriyal ATP üretimlerini de anlamlı olarak arttırmıştır. Bu çalışma sonucunda ilk kez H.felis ile hem kısa (6 saat) hem de uzun (24 saat) süre uyarılmış fare dalak B hücrelerinde rBAFF'ın hücre canlılığına ve fonksiyonuna olan etkisi araştırılmıştır. Aynı zamanda yine ilk kez H.felis ile hem kısa (6 saat) hem de uzun (24 saat) süre uyarılmış fare dalak B hücrelerinde enerji üretimi için gereken metabolik profilin nasıl karakterize olduğu araştırıldığından çalışmanın özgünlük değeri yüksektir. Yapılan bu çalışma, özellikle mide kanserine sebep olan Helikobakter enfeksiyonunda B hücrelerinin nasıl metabolik olarak yeniden programlandığını gösterirken, aynı zamanda ileride yapılacak çalışmalarda hangi metabolik yolakların hedeflenmesi gerektiği, helikobacter enfeksiyonunda diğer biyomoleküllerin etkisinin metabolizma üzerinde nasıl olacağının irdelenmesinin önemini de göstermektedir. Bu hastlığa karşı geliştirilecek olan ilaç ve aşıların hedef alacakları metabolik yolaklar ve hücresel mekanizmalar için bu çalışma önem taşımaktadır.

Özet (Çeviri)

Helicobacter pylori is a gram-negative, spiral-shaped and microaerophilic bacterium. It has been declared as type 1 carcinogen by the World Health Organization since it causes stomach cancer. Although more than 50 % of the world's population is infected with this bacterium, only 10-20 % of them have serious gastrointestinal diseases. For the development of infection-disease murine models, H.felis which is instead of H.pylori can be used. The immune system is the system of defense and protection against any infectious disease. It is categorized into two groups as innate and adaptive. An early line of defense against microbes is formed by innate immunity. Innate immunity includes both cellular and biochemical defense mechanisms that are present even before infection and are ready to respond immediately to infections. On the other hand, adaptive immunity becomes active when the organism encounters an infectious agent. Memory response generation is one of the most basic features of adaptive immunity. B cells play a significant role in the regulation of immune response due to the key functions including antibody production and antigen presentation. The regulatory role of B cells was shown with the use of mice lacking B cells which could not overcome autoimmune encephalitis. Helicobacter felis stimulates B cells via TLR2 and Myd88 and suppress immune responses. This suppression brings about persistency of bacteria in gastric mucosa Therefore, a balance between regulatory and effector response could determine the fate of infection. As demonstrated by our previous laboratory studies, H. felis-mediated activation of B cells induces two different B cell subgroups: IL-10- producing IL-10+ B cells and TGF-β-producing IL- 10- B cells. When a resting immune cell encounters an antigen, it undergoes metabolic reprogramming. The metabolic profile of immune cells for energy production plays a significant role in the regulation of the immune system. The energy (ATP) production mechanism required by immune cells during proliferation and differentiation into an effector cell differs from cell to cell. Glucose which is one of the key biomolecules used as the basis for ATP production is taken into the cell via glucose transporters and metabolized during glycolysis. The pyruvate formed at the end of glycolysis can pass into the mitochondria and enter the TCA cycle, increasing oxidative phosphorylation, or it can remain in the cytoplasm and produce lactate. The oxidative phosphorylation pathway can also utilize fatty acids and amino acids. Glycolysis and oxidative phosphorylation are the two main pathways involved in energy production in the cell. Studies have shown that there is a decrease in the proliferation of LPS-stimulated B cells treated with 2-DG, a glycolysis inhibitor. In addition, it has been reported that treatment of B cells with oligomycin, an ATPsynthase inhibitor, during stimulation with anti-CD-40 and IL-4, decreases the activation marker CD86 and cell viability. However, there is no information in the literature about how B cells undergo metabolic reprogramming when stimulated by Helicobacter species. B cells that do not receive stimulation in cell culture can not maintain their viability for a long time. In a study, a low dose of recombinant B cell-activating factor (rBAFF) was added to B cell culture and increased the viability of the cells. Based on this information, it was aimed to investigate the effect of rBAFF on Helicobacter-activated B cell viability and function since cell viability was very critical in the metabolic analysis studies that would follow. B cells isolated by magnetic separation from C57BL/6 mouse spleen were stimulated with H.felis sonicate, PAM3CSK4, and LPS for 6 and 24 hours. The main purpose of choosing 6h time point is to investigate how cells respond only in the presence of stimuli before they proliferate, and the main reason for choosing the 24h time point is that B cells begin to secrete the anti- inflammatory cytokine IL-10. To increase the viability of B cells in the culture, the effect of rBAFF added at a low dose on the viability is determined by the flow cytometry, its effect on the function with the expression levels of CD86 and CD9 surface markers in the flow cytometry again, and the effect on the IL-10 secretion level by the IL-10 ELISA method. researched with. Although rBAFF added to the B cell culture medium significantly increased the viability of the control group, which did not receive stimulation, it was excluded from the experimental plan because it would affect the results of metabolism studies since it changed the IL-10 levels of the cells. Because rBAFF was intended to be given to the control group, which was not stimulated in metabolism studies, in case it did not show any effect on the function while increasing B cell viability, rBAFF was not given to the experimental groups since it slightly changed the IL-10 production levels of B cells. Another aim of the study is to investigate how the metabolic profile of splenic B cells stimulated with H.felis is characterized. The metabolic flux analysis method was used to determine which pathways are activated for the required energy production while becoming an effector by being exposed to stimuli from the resting state. B cells were cultured with H.felis sonicate, PAM3CSK4, and LPS for 6 and 24 hours, and then the change in energy metabolism was measured in XFe96 device by extracellular flux analysis method. Since the number of dead cells exceeding 20 % would adversely affect the results of metabolism studies, dead cell removal was performed by the magnetic separation method, especially in the control groups. Only cells with high viability were included in the metabolism studies. The proportion of viable cells in the non-stimulated groups increased from 50% to 80% after the magnetic removal of dead cells. Since the viability data of the stimulus groups were suitable for metabolism experiments, no dead cell separation was made in these groups. According to the results obtained from our study, as a result of stimulation of B cells with H.felis sonicate, PAM3CSK4 and LPS for 24 hours, glycolysis and glycolytic capacity tend to increase significantly as a result of the measured ECAR data. Although the groups that received stimulation at 6 hours increased both glycolysis and glycolytic capacity compared to the control groups that did not receive stimulation, this rate is much less when compared to 24-hour stimulation. Basal and maximum OCR values of cells are directly proportional to the amount of oxygen they consume during OXPHOS. As a result of stimulation of B cells with H.felis sonicate, PAM3CSK4 and LPS for 24 hours, both basal and maximum OCR values increased significantly compared to the non-stimulated groups. This increased rate is much lessin the 6-hour warning groups. The OCR data also gives information about the mitochondrial ATP production of the cells. B cells stimulated with H.felis sonicate, PAM3CSK4 and LPS also significantly increased their mitochondrial ATP production after 24 hours. As a result of this study, the effect of rBAFF on cell viability and function was investigated for the first time in mouse splenic B cells stimulated with H.felis for both short (6 hours) and long (24 hours) periods. At the same time, the specificity of the study is high since it was investigated for the first time how the metabolic profile required for energy production is shaped in mouse splenic B cells stimulated with H.felis for both short (6 hours) and long (24 hours) periods.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    771655

    Investigation of the mitochondrial metabolism of Helicobacter-activated B cells

    Helikobakter ile aktive edilmiş B hücrelerinin mitokondriyal metabolizmasının araştırılması

    ZEYNEP NUR ŞENTÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. AYÇA SAYI YAZGAN

  2. Tez No

    761642

    Tıbbi jeoloji amaçlı modifiye edilmiş Nano-Montmorillonit'in üst-gastrointestinal sistem hastalıklarına neden olan mikroorganizma üzerine etkisinin araştırması

    Investigation of the effect of nano-montmorillonite modified for medical geology purposes on microorganism causing upper-gastrointestinal system diseases

    SHAHRIYAR KARIMDOUST

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    Jeoloji MühendisliğiAtatürk Üniversitesi

    Jeoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EKREM KALKAN

  3. Tez No

    521523

    Investigation of the effect of curcumin on helicobacter pylori 5'-methylthioadenosine/s-adenosylhomocysteine nucleosidase with molecular dynamics method

    Kurkuminin helikobakter pilori 5'-methylthıoadenosıne/s-adenosylhomocysteıne nucleosıdase üzerine etkisinin moleküler dinamik yöntemi ile incelenmesi

    MAHDI IBRAHIM SAEED SAEED

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyofizikSiirt Üniversitesi

    Fizik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ AHMET YILDIRIM

  4. Tez No

    246250

    Reconstruction of cardiomyocyte energy metabolism and investigation of the healthy and disease cases by fba and optimization techniques

    Kalp hücrelerinde enerji metabolizmasının oluşturulması ve sağıklı ve hastalık koşullarının metabolizma mühendisliği teknikleri ile incelenmesi

    ÇİĞDEM FİLİZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    Kimya MühendisliğiBoğaziçi Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Bölümü

    PROF. KUTLU ÜLGEN

  5. Tez No

    892439

    Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde enerjimetabolizması aktivitesinin genetik kodlanmışbiyosensörler ile incelenmesi

    Investigation of energy metabolism activity in brainmicrovascular endothelial cells using geneticallycoded biosensors

    MELİKE TUĞBA ÜVAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Biyolojiİstanbul Medipol Üniversitesi

    Sinir Bilimi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜRKAN ÖZTÜRK

Geri Dön