İnsan karbonik anhidraz VII enzim geninin eE coli'de klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı antibiyotiklerin bu enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Cloning and expression of human carbonic anhydrase VII gene in E. coli, purification, characterization of recombinant enzyme and investigation of some antibiotics effects on enzyme activity
- Tez No: 512370
- Danışmanlar: PROF. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu çalışmada, insan beyin cDNA'sı kullanılarak amplifiye edilen karbonik anhidraz VII (CA VII) geni Escherichia coli (One Shot® Mach1™-T1R) suşuna klonlandı. Rekombinant plazmit, koloni PCR ve sekans analizi ile doğrulandıktan sonra protein ekspresyonu için Escherichia coli BL21 (DE-3) suşuna transforme edildi. 6 saat sürede izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozit (IPTG) indüksiyonu ile CA VII ekspresyonu gözlendi. Daha sonra hekzahistidin (6xHis) içeren füzyon protein ProbondTM nikel şelatlayıcı reçineli afinite kolonu kullanarak %48,07 verim ve 7,02 EU/mg spesifik aktivite ile yaklaşık 21 kat saflaştırma katsayısıyla saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini tespit etmek amacıyla SDS-PAGE yapıldı. SUMO-hCA VII füzyon proteininin kütlesi 46,77 kDa olarak belirlendi. Anti-His G-HRP antikoru kullanılarak yapılan Western blot analizi sonucunda yaklaşık 45 kDa'luk füzyon protein tespit edildi. Ayrıca saflaştırılan rhCA VII enziminin karakterizasyonu yapılarak enzimin optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, aktivasyon enerjisi, aktivasyon entalpisi, Q10, KM ve Vmax değerleri belirlendi. Daha sonra saf olarak elde edilen rekombinant enzim aktivitesi üzerine bazı antibiyotiklerin etkileri araştırıldı. İnhibisyon etkisi gösteren antibiyotikler için Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ile inhibisyon tipleri tespit edildi.
Özet (Çeviri)
In this study, carbonic anhydrase VII (CA VII) was cloned into Escherichia coli (One Shot® Mach1™-T1R) strain by using cDNA of human brain and successfully expressed. The integrity of the constructed plasmid was confirmed by colony PCR and it was transformed into Escherichia coli BL21 (DE-3) strain for protein expression. CA VII expression was observed by induction of isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) for 6 hours. Then, the fusion protein containing hexahistidine (6xHis) was then purified with 7,02 EU/mg of specific activity, 48.07% of purification yield and approximately 21 of purification folds using a ProbondTM nickel chelating resin affinity column. SDS-PAGE was performed to check the purity of the purified enzyme and determine the molecular mass. The mass of the SUMO-hCA VII fusion protein was determined to be 46.77 kDa. As a result of Western blot analysis using Anti-His G-HRP antibody, fusion protein was detected approximately 45 kDa. In addition, optimal pH, optimal ionic strenght, optimal temperature, activation energy, activation enthalpy, Q10, KM and Vmax values of enzyme were determined by characterization of purified rhCA VII enzyme. Then, the effects of some antibiotics on pure recombinant enzyme activity were investigated. For antibiotics with an inhibitory effect, inhibition types were determined with Ki constants using Lineweaver-Burk graphs.
Benzer Tezler
- İzmir'de Mustafa Kemal Bulvarı'nın peyzaj mimarlığı açısından etüdü ve peyzaj projesi
Başlık çevirisi yok
ENGİN ALPARSLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
1985
Peyzaj MimarlığıEge ÜniversitesiPeyzaj Mimarlığı Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ÜMİT ERDEM
- Çukurova bölgesinde biyoklimatik veriler kullanılarak açık ve yeşil alan sistemlerinin belirlenmesi ilkeleri üzerinde bir araştırma
A research on the determination of the principles in open and green spaces systems by using the bioclimatic data in Çukurova region
MEHMET FARUK ALTUNKASA
Doktora
Türkçe
1987
Çevre MühendisliğiÇukurova ÜniversitesiPeyzaj Mimarlığı Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ERDOĞAN GÜLTEKİN
- Konut bölgelerinde parsel düzeni uygulamasının kent topraklarının rasyonel kullanımı çerçevesinde mimari açıdan değerlendirilmesi
An Architeet's Criticism of the Currently Practised method of plot formation in residential areas from the point of View of rational utilization of urban deatories
SUZAN ESİRGEN
Yüksek Lisans
Türkçe
1986
Şehircilik ve Bölge PlanlamaGazi ÜniversitesiŞehir ve Bölge Planlama Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. UMUR ERKMAN
- Ankara-Kızılcahamam karayolunda meydana gelen trafik kazalarında insan faktörü
Başlık çevirisi yok
CELAL AKBULUT
Yüksek Lisans
Türkçe
1987
UlaşımGazi ÜniversitesiKazaların Çevresel ve Teknik Araştırması Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. RIDVAN EGE
- 1985-1986 yıllarında Polatlı Devlet Hastanesine kaza nedeniyle başvuranların incelenmesi
Başlık çevirisi yok
FERHAN ŞENOL
Yüksek Lisans
Türkçe
1986
İlk ve Acil YardımGazi ÜniversitesiKazaların Çevresel ve Teknik Araştırması Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
DOÇ. DR. HİKMET PEKCAN