İnsan karbonik anhidraz VII enzim geninin eE coli'de klonlanması, ekspresyonu, rekombinant enzimin saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı antibiyotiklerin bu enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Cloning and expression of human carbonic anhydrase VII gene in E. coli, purification, characterization of recombinant enzyme and investigation of some antibiotics effects on enzyme activity
- Tez No: 512370
- Danışmanlar: PROF. DR. ŞÜKRÜ BEYDEMİR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 142
Özet
Bu çalışmada, insan beyin cDNA'sı kullanılarak amplifiye edilen karbonik anhidraz VII (CA VII) geni Escherichia coli (One Shot® Mach1™-T1R) suşuna klonlandı. Rekombinant plazmit, koloni PCR ve sekans analizi ile doğrulandıktan sonra protein ekspresyonu için Escherichia coli BL21 (DE-3) suşuna transforme edildi. 6 saat sürede izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozit (IPTG) indüksiyonu ile CA VII ekspresyonu gözlendi. Daha sonra hekzahistidin (6xHis) içeren füzyon protein ProbondTM nikel şelatlayıcı reçineli afinite kolonu kullanarak %48,07 verim ve 7,02 EU/mg spesifik aktivite ile yaklaşık 21 kat saflaştırma katsayısıyla saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini tespit etmek amacıyla SDS-PAGE yapıldı. SUMO-hCA VII füzyon proteininin kütlesi 46,77 kDa olarak belirlendi. Anti-His G-HRP antikoru kullanılarak yapılan Western blot analizi sonucunda yaklaşık 45 kDa'luk füzyon protein tespit edildi. Ayrıca saflaştırılan rhCA VII enziminin karakterizasyonu yapılarak enzimin optimum pH, optimum iyonik şiddet, optimum sıcaklık, aktivasyon enerjisi, aktivasyon entalpisi, Q10, KM ve Vmax değerleri belirlendi. Daha sonra saf olarak elde edilen rekombinant enzim aktivitesi üzerine bazı antibiyotiklerin etkileri araştırıldı. İnhibisyon etkisi gösteren antibiyotikler için Lineweaver-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ile inhibisyon tipleri tespit edildi.
Özet (Çeviri)
In this study, carbonic anhydrase VII (CA VII) was cloned into Escherichia coli (One Shot® Mach1™-T1R) strain by using cDNA of human brain and successfully expressed. The integrity of the constructed plasmid was confirmed by colony PCR and it was transformed into Escherichia coli BL21 (DE-3) strain for protein expression. CA VII expression was observed by induction of isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) for 6 hours. Then, the fusion protein containing hexahistidine (6xHis) was then purified with 7,02 EU/mg of specific activity, 48.07% of purification yield and approximately 21 of purification folds using a ProbondTM nickel chelating resin affinity column. SDS-PAGE was performed to check the purity of the purified enzyme and determine the molecular mass. The mass of the SUMO-hCA VII fusion protein was determined to be 46.77 kDa. As a result of Western blot analysis using Anti-His G-HRP antibody, fusion protein was detected approximately 45 kDa. In addition, optimal pH, optimal ionic strenght, optimal temperature, activation energy, activation enthalpy, Q10, KM and Vmax values of enzyme were determined by characterization of purified rhCA VII enzyme. Then, the effects of some antibiotics on pure recombinant enzyme activity were investigated. For antibiotics with an inhibitory effect, inhibition types were determined with Ki constants using Lineweaver-Burk graphs.
Benzer Tezler
- İnsan karbonik anhidraz 1 ve 2 izoenzimleri üzerine bazı ilaçların in vitro ve tavşanlar üzerinde in vivo etkisinin incelenmesi
The investigation of the effects of some antineplastic,analgesic and anesthetic drugs on erytrocyte carbonic anhydrase activity invitro and invivo
KONCA ALTINKAYNAK
- Yeni sekonder sülfonamidlerin sentezi ve in vitro karbonik anhidraz izoenzimleri üzerine inhibisyon aktivitelerinin incelenmesi
Synthesis of novel secondary sulfonamides and their in vitro carbonic anhydrase isozymes inhibition effects
TANER GÖKÇEN
Doktora
Türkçe
2017
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TURAN ÖZTÜRK
DOÇ. DR. AHMET C. GÖREN
- Hipoksik koşullarda farklı hücre hatlarında ve C.elegans' da karbonik anhidraz VII, karbonik anhidraz VII benzeri genlerin regülasyonu
Regulating Of Ca VII, Ca VII-like gene expression in different cell şines and C.elegans in hypoxic conditions
AYSU BOZKURT
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyolojiBalıkesir ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SÜMEYYE AYDOGAN TÜRKOĞLU
DR. ÖĞR. ÜYESİ DERYA OKUYAN
- İnsan karbonik anhidraz ıı enziminin (hCA II) klonlanması, E. coli'de ekspresyonu, karakterizasyonu, yönlendirilmiş mutagenez ile mutant hCA II genlerinin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning, expression in E. coli, characterization of human carbonic anhydrase ii (hCA II) enzyme, production of mutant hCA II genes by site directed mutagenesis and investigation of affinity of mutant proteins to inhibitors
DERYANUR KILIÇ
- İnsan karbonik anhidraz III geninin transkripsiyonel regülasyonu
Transcriptional regulation of human carbonic anhydrase III gene
DERYA OKUYAN ALTAN