Geri Dön

Investigation of micrornas that interact with the NFIX 3′untranslated region

NFIX 3'utr bölgesi ile etkileşen mikrornaların araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 518566
  2. Yazar: ECE ÇAĞDAŞ
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 93

Özet

Nükleer Faktör I (NFI) transkripsiyon faktörü ailesi embriyo ve yetişkinlerdeki önemli hücresel ve gelişimsel olayları kontrol etmektedir. Omurgalılarda bu aile NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX proteinlerinden oluşmaktadır. NFI genlerinin basit prokaryot ve ökaryotlarda bulunmamasından dolayı bu gen ailesinin metazoan evrimi sırasında ortaya çıktığı düşünülmektedir. Her NFI proteinin N-ucu DNA'ya bağlanma ve dimerleşme bölgesi ile C-ucu transkripsiyon aktivasyon ve baskılanma bölgesi içerir. N-ucu DNA'ya bağlanma ve dimerleşme bölgesi tüm NFI proteinlerinde korunmaktadır, C-ucu bölgesi ise varyantlar arasında daha fazla farklılık göstermektedir. Tüm NFI proteinleri N-ucu domeni bölgesinde dört korunmuş sistein aminoasiti içermektedir; bunların üçü DNA'ya bağlanma, dördüncü sistein ise oksidasyon hassaslığı için gereklidir. NFI'lar genom üzerinde TTGGC(N5)GCCAA dizisine homo- veya heterodimer olarak bağlanmaktadırlar. NFI proteinleri merkezi sinir sistemi, diş, akciğer, kas ve iskelet dokularındaki kök hücre farklılaşmasında görev alan genlerin ifadesini kontrol etmektedirler. NFIlar hücre ve dokuya özgü olmak üzere çeşitli mekanizmalarla gen ifadesini kontrol ederler. Bu mekanizmalara örnek olarak genel transkripsiyon faktörleriyle etkileşim, diğer transkripsiyon faktörleriyle kompleks oluşturma, nükleozom yapısının değiştirilmesi, koaktivatör/korepresörlerle etkileşim, promotorun metilasyon örüntüsünün değiştirilmesi verilebilir. NFIA, NFIB ve NFIX embriyonik gelişimde boyunca merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinde ifade edilirken, yetişkin beyninde sadece kök hücrelerde bulunur. In vivo çalışmalarda Nfia, Nfib ve Nfix genleri silinen farelerde korteks, hipokampus, serebellum ve omurilik gibi bölgelerin gelişiminin, glia veya nöron farklılaşması, nöron göçü ve akson oluşumu mekanizmalarının bozulmasına neden olduğu gösterilmiştir. Nfic geni silinen farelerde ise beyinde bir bozukluk fenotipi görülmediği için bu NFI proteininin merkezi sinir sisteminde işlevi olmadığı düşünülmektedir. Nfia, Nfib ve Nfix yokluğunda farelerin serebral korteks bölgesindeki ventriküllerin genişlediği saptanmıştır, bu da nöral projenitör farklılaşmasındaki bozuklukları işaret etmektedir. NFI'lar beyincikteki nöronal göç ve terminal farklılaşması için gereklidir, serebellar granül nöronlarındaki hücredışı sinyal molekülü (Wnt) ve hücre adhezyon moleküllerinin (Ephrin-B1, N-cadherin ve Tag1) ekspresyonlarını indükler. Nfix hipokampüste hücre yenilenmesinde rol oynayan transkripsiyon faktörü Sox9 ifadesini baskılayarak nöron farklılaşmasını aktive eder. Nfix geni silinen post-natal farede projenitör hücre belirteçlerinin (Pax6, Hes1, Hes5 ve Sox2) artması, bunun projenitör hücre oluşumunun arttığı ve nöron ve glia farklılaşmasında bozukluklar olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, Nfix nöronal göçü düzenlerken, burun soğanındaki projenitör hücreleri yönlendiren bir nörotropik faktör olan Gdnf hedef genini tetiklemektedir. Omurilikte ise Nfia ve Nfib astrosit farklılaşma belirteci olan Gfap ifadesini arttırarak astrosit farklılaşma sürecini başlatmakta, daha sonra Nfix ekspresyonu Nfib tarafından indüklenmektedir. Nfix ise Gfap ve diğer astrosite özgü genlerin anlatımını aktifleştirerek terminal astrosit farklılaşmasında görev alır. Nöral gelişimdeki rolüne ek olarak, Nfix yetişkin hipokampusdaki kök hücrelerin farklılaşmadan sessiz durumda kalmasını sağlamakta, aynı zamanda nöral farklılaşmada da rol oynamaktadır. Hücre kültüründe, Nfix'in sessiz hücrelerde ifadesinin arttığı ve hücrelerin bölünmeden, sessiz kalması için gerekli ve yeterli olduğu saptanmıştır. Bunun yanısıra, Nfix geni koşullu olarak silinen farelerde Nfix'in nöroblast oluşumunu desteklediği, oligodendrositlere özgü genlerin (Olig1, Olig2, Ptprz1 ve Ntrk2) ifadesini engelleyerek oligodendrosit farklılaşmasını baskıladığı olarak gösterilmiştir. Buna ek olarak, Nfix eksikliğinde nöron sayısı azalmakta, dendrit ve proses dallanması süreçlerinde bozukluklar tespit edilmektedir. Görüldüğü gibi, NFIX yetişkin nörogenezinde kök hücrelerin bölünmeden sessiz kalması ve hücre kaderinin nöron veya astrosit olarak belirlenmesinde görev almaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda transkripsiyon sonrası düzenleme mekanizmaları ile miRNAların merkezi sinir sistemi gelişimi ve kanserlerinde hücre proliferasyonunu düzenlediği tespit edilmiştir. NFI'ların (Nfia ve Nfib) miRNAlar tarafından baskılanmasıyla nöral projenitör hücrelerin farklılaşmasının erken olması engellenmektedir. Ayrıca, NFIA tumör baskılayıcı genlerin ekspresyonunu baskılaması nedeniyle, NFIA-miRNA etkileşimi glioma tümorlerinin oluşumunda rol oynamaktadır. NFIX'i baskılayan miRNAların (miR1290, miRHCC1 ve miR744) özfagus, yumurtalık ve hepatosellüler kanserlerde NFIX'in tümör supresör rolü olduğunu göstermektedir. Şu ana kadar yapılan çalışmalarda, NFIX'i hedefleyen miRNAların merkezi sinir sistemindeki fonksiyonu henüz tespit edilememiştir. Daha önce yapılan çalışmamızda farklılaşan nöral kök hücrelerde NFIX ifadesinin baskılandığı gösterilmiş, NFIX'i post-transkripsiyonel olarak düzenleyen mekanizmaları aydınlatmak amacıyla NFIX 3'UTR bölgesindeki miRNA bağlanma bölgeleri analiz edilmiştir. Biyoinformatik analizler sonucu 16 adet miRNA'nın NFIX 3'UTR varyantlarında korunan bölgelere bağlanma potansiyeli olduğu saptanmıştır. İnsan nöral projenitör hücrelerinde yüksek düzeyde ifade edilen miRNAlar, miR25, miR92b, miR124, miR363 NFIX'i hedefleyebilecek miRNAlar olarak incelenmek üzere seçilmiştir. Buna ek olarak, NFIX'i baskıladığı daha önce gösterilmiş olan miR1915 pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. miRNAların NFIX ekspresyonuna etkisini görebilmek için raportör gen analizi yapılmıştır. İlk olarak, seçilen miRNAların bağlanma bölgelerini içeren NFIX 3'UTR parçası (~1300-2600 nt) insan genomic DNAsından çoğaltılarak TOPO vektörüne ve daha sonra raportör gen içeren pmiRGLO lusiferaz vektörüne klonlanmıştır. Ekspresyon baskılama düzeyini gösteren lusiferaz analizi için seçilen miRNAların mimikleri kullanılmıştır. Pozitif kontrol olarak kullanılan miR1915'in NFIX 3'UTR-I ile birlikte ifade edilen raportör genlerin translasyonunu baskıladığı görülmemiştir. Ne var ki, mimik aktivitesini teyit edebileceğimiz başka bir UTR konstraktı elimizde bulunmadığı için mimik aktivitesi teyit edilememiştir. miR25 ve miR363'ün NFIX 3'UTR lusiferaz aktivitesini baskıladığı saptanmıştır. Ön veriler, miR124 ve miR92b mimiklerinin NFIX ifadesine etkisi olmadığını göstermiştir. İleriki çalışmalarda, miRNAların NFIX 3'UTR ile etkileşiminin spesifik olup olmadığı miRNAların NFIX 3'UTR bağlanma bölgelerinin mutagenez ile değiştirilmesi yoluyla belirlenecektir. Ayrıca, NFIX 3'UTR'deki spesifik dizilere bağlanan miRNAların NFIX anlatımını baskılamasının fizyolojik etkisi de araştırılacaktır.

Özet (Çeviri)

Nuclear factor I (NFI) transcription factor family controls many important cellular and developmental events in the embryo and the adult. This family is made up of four members in vertebrates: NFIA, NFIB, NFIC and NFIX. NFIs carry an N-terminal DNA binding-dimerization and a C-terminal transcriptional activation and repression domain which includes a proline-rich region. The N-terminal DNA binding and dimerization domain is highly conserved among NFI members, while the C-terminal domain varies. There are four conserved cysteine residues in the NFI N-terminal domain, one of which is sensitive to oxidative inactivation while the other cysteine residues are necessary for NFI DNA binding capacity. NFIs bind as homo- or heterodimers to the TTGGC(N5)GCCAA consensus sequence on duplex DNA. NFIs can regulate gene expression in a cell and tissue specific manner by various mechanisms: interaction with basal transcription factors, co-regulation with other transcription factors, binding to co-activators or co-repressors, alteration of the nucleosome structure and modification of the methylation pattern near the promoter of the target gene. NFIA, NFIB and NFIX are expressed in neural progenitors, neurons and glia of the central nervous system during embryonic development, however expression of these NFI members is restricted to stem cells in the adult brain. NFIs regulate processes such as neurogenesis and gliogenesis in different brain regions in the embryo and the survival of progenitor cells in adults. Nfia, Nfib and Nfix null mice demonstrate enlarged ventricles in the cerebral cortex, indicating misregulation of differentiation and neural progenitors. In the cerebellum, NFIs are required for neuronal migration and terminal differentiation and in cerebellar granule neurons they regulate the expression of molecules that are associated with these processes such as the extracellular signaling molecule (Wnt), cell adhesion molecules (Ephrin-B1, N-cadherin and Tag1). Nfix promotes neurogenesis by repressing of Sox9, a transcription factor involved in stem cell self-renewal in hippocampus. In Nfix null post-natal mice, progenitor cell specific markers (Pax6, Hes1, Hes5 and Sox2) are upregulated indicating expansion of progenitors while neuronal and glial differentiation is disrupted as well. In addition, Nfix also regulates neuronal migration, and one of its targets is a neurotropic factor (Gdnf) that promotes migration of progenitors in the olfactory bulb. In the spinal cord, Nfia and Nfib both induce Gfap expression, an astrocyte differentiation marker, Nfib also induces Nfix expression. Nfix, in turn, regulates astrocyte terminal differentiation by upregulation of Gfap and other astrocyte specific genes. In addition to its role in development, Nfix also involved in the regulation of stem cell quiescence and neurogenesis in the adult hippocampus. Interestingly, in cell culture, Nfix is upregulated in quiescent stem cells and is necessary and sufficient to induce quiescence. On the other hand, conditional knock-out experiments show that Nfix promotes neuroblast differentiation and represses oligodendrogenesis inhibiting expression of oligodendrocyte specific genes (Olig1, Olig2, Ptprz1 and Ntrk2) in vivo. Moreover, Nfix deletion in mice leads to fewer neurons and disrupted dendritic formation and process branching. Therefore, NFIX may have a dual role in adult neurogenesis: preserving stem cell quiescence and cell fate determination to neurons and astrocytes. Previously, we found that NFIX expression is downregulated in differentiating neural stem cells in vitro. In order to identify novel upstream regulators of NFIX, we first analyzed miRNA binding sites on the NFIX 3'UTR. We selected miRNAs which are highly expressed in neural progenitor cells for further analysis: miR25, miR92b, miR124 and miR363. Additionally, miR1915 which was reported to supress NFIX is selected as positive control. NFIX 3'UTR fragments which contain binding sites of these miRNAs were isolated, fragment I (nts ~1300-2600) was inserted in the downstream of the luciferase reporter gene. Then, supression of reporter gene translation by miRNA mimics was assayed. miR25 and miR363 repress luciferase activity from the NFIX 3'UTR I, while preliminary data indicate that miR92b and miR124 did not have such an effect. Interestingly, miR1915 could not repress translation of reporter genes fused to NFIX 3'UTR I. However, the activity of this mimic has not been validated yet. We are in the process of mutating the miR25 and miR363 binding sites on the NFIX 3'UTR to ascertain the specificity of these interactions. Future studies will explore the physiological significance of potential supression of NFIX by these miRNAs.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    439645

    The investigation of angiogenic mechanisms associated with miRNA-126 signalling pathway molecules in atherosclerosis

    Aterosklerozda miRNA-126 sinyal yolağı molekülleri ile ilişkili mekanizmaların araştırılması

    ÇİĞDEM SEZER ZHMUROV

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Bilim ve Teknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HAKAN BERMEK

    DOÇ. DR. TUNÇ ÇATAL

  2. Tez No

    299165

    Investigation of tRNA-derived small RNAs in Drosophila melenogaster

    Drosophila melanogaster' de tRNA kaynaklı küçük RNA'ların araştırılması

    ÇAĞDAŞ GÖKTAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Genetikİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. BÜNYAMİN AKGÜL

  3. Tez No

    66623

    Küçük titreşim ölçümleri ve dolgu duvarlarının mekanik modele yansıtılması

    Başlık çevirisi yok

    UMUT DEVRİM ERSİN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1997

    İnşaat Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İnşaat Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. H. FARUK KARADOĞAN

  4. Tez No

    75415

    Anyonik reaktiflerin sepiyolit tarafından adsorplanma mekanizması

    Başlık çevirisi yok

    MUSTAFA ÇINAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1998

    Maden Mühendisliği ve Madencilikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Maden Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET SABRİ ÇELİK

  5. Tez No

    649884

    Coiled-coil domain containing 124 (Ccdc124) proteininin mikroRNAlar tarafından regülasyonunun incelenmesi

    Investigation of regulation by microRNAs of coiled-coil domain containing 124 (Ccdc124) protein

    İLKAY SEVGEN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY

    DR. MERVE TUZLAKOĞLU ÖZTÜRK

Geri Dön